fot. Istock

TITLE: The importance of modern molecular diagnostics in cancer therapy

STRESZCZENIE: W ostatnim dziesięcioleciu w Polsce zapadalność na choroby nowotworowe wzrosła o prawie 28%, przy niezmiennym rozkładzie najliczniej występujących nowotworów. Liczba zgonów związanych z rakiem wzrosła znacząco mniej (7%). Przedstawiono wybór akceptowanych terapii celowanych, wskazując na potrzebę multidyscyplinarnego podejścia do diagnostyki i planowania terapii. Metody osiągnięcia skrócenia oczekiwania na podjęcie skutecznej terapii, na podstawie dostępnego piśmiennictwa, upatruje się w uproszczeniu i uporządkowaniu procedur przepływu informacji oraz wyboru najprostszych, najkrótszych, a jednocześnie pewnych metod diagnostyki molekularnej

SŁOWA KLUCZOWE: choroby nowotworowe, terapia celowana, szybka diagnostyka

SUMMARY: During the last decade, the incidence rate of cancer diseases in Poland has increased by almost 28%, while the distribution of the most frequent neoplasms has remained unchanged. In this period, an increase in cancer-related deaths has been significantly lower (7%). This paper presents commonly accepted modern targeted therapies, indicating the need for a multidisciplinary approach to proper diagnostics and therapy planning. Based on the available literature it can be concluded, that the simplification of procedures, organising the flow of data and the selection of the simplest, shortest and most reliable molecular diagnostic methods are the best ways to reduce waiting time for treatment.

KEYWORDS: cancer, targeted therapy, quick diagnostics

Wzrost zapadalności na choroby nowotworowe na świecie i w Polsce jest faktem. Według danych Krajowego Rejestru Nowotworów, w całej populacji (kobiet i mężczyzn w wieku do 85 lat) liczba ta wzrosła z 128 889 w 2007 r. do 164 875 w 2017 r. (wzrost o 27,9%). Warto przy tym zauważyć, że w tych samych latach liczba zgonów wzrosła z 92 936 do 99 644 (wzrost o 7%) [1]. Bez wskazywania na przyczynę trendu trzeba go jednak uwzględnić. Interesująca jest obserwacja dziesięciu najczęstszych przyczyn zgonu. W ciągu dziesięciu lat „pierwsza dziesiątka” się nie zmieniła. Pierwszymi przyczynami śmierci nieodmiennie pozostają nowotwory płuca i oskrzela oraz jelita grubego, które razem są przyczyną ponad 30% zgonów związanych z nowotworami. Dokładne dane liczbowe w tab. 1.

Jedną z przyczyn wykazanego wzrostu zachorowań może być większa skuteczność (i dostępność) odpowiedniej diagnostyki oraz pojawienie się nowych terapii spersonalizowanych opartych o leczenie ukierunkowane molekularnie.
Współczesna medycyna coraz bardziej traktuje pacjenta w sposób indywidualny, dobierając sposób leczenia do indywidualnych cech biologicznych, biochemicznych i molekularnych nie tylko choroby, ale choroby w kontekście osoby jako jednostki. W błyskawicznym tempie rośnie liczba zarejestrowanych leków/terapii skierowanych w konkretnych nowotworach, przy jednoczesnym występowaniu konkretnych mutacji somatycznych.

W Polsce zatwierdzone są i refundowane programy lekowe, w których ma zastosowanie celowana terapia molekularna. W tab. 2 przedstawiono wybór leków związanych z leczeniem najczęściej występujących nowotworów. Wykaz leków refundowanych i programów lekowych (nie tylko w onkologii) jest uaktualniany obwieszczeniem Ministra Zdrowia, publikowanym na stronie Ministerstwa http://dziennikmz.mz.gov.pl/#/actbymonths. W niniejszej publikacji korzystano z aktualnego obwieszczenia [2].

Bieżąco aktualizowany wykaz leków opartych na przeciwciałach monoklonalnych dopuszczonych do stosowania w Unii Europejskiej lub USA można znaleźć na stronie: https://www.antibodysociety.org/resources/approved-antibodies/.

Nowe metody leczenia wymagają nowego podejścia diagnostycznego. Oprócz bardzo ważnych testów analitycznych, biochemicznych czy patomorfologicznych (bez nich dalsza diagnostyka jest wręcz niemożliwa, więc ekscytując się nowymi metodami diagnostyki, nie możemy zapominać, że jest to tylko/aż następny krok), wielką rolę odgrywa diagnostyka molekularna łącząca występowanie nieprawidłowości na poziomie DNA ze skutecznością leków nowej generacji. Zależność terapii z molekularnym celem wskazano w tab. 1 i 2.

Tak więc terapia onkologiczna stała się dziedziną interdyscyplinarną, gdzie ostateczna decyzja w sprawie rodzaju podjętego leczenia zależy od grupy specjalistów: klinicystów, diagnostów oraz biologów molekularnych [4, 5]. Z jednej strony daje to niezwykłą możliwość doboru leczenia do specyfiki pacjenta, z drugiej, ze względu na konieczność porozumienia wielu specjalistów, wydłuża czas od pierwszej diagnozy do wdrożenia skutecznego leczenia.

Konieczne staje się poszukiwanie metody skrócenia czasu od diagnostyki do podjęcia leczenia. W USA w szpitalach wdrażających zalecenia Krajowej Sieci ds. Raka uzyskano skrócenie tego czasu o 29% (z 62 do 44 dni), stosując tylko administracyjne metody kontroli jakości i poprawę systemu przepływu informacji w szpitalu [6].

W Polsce skróceniu czasu oczekiwania na leczenie pacjentów z rakiem miało służyć wdrożenie Diagnostyki i Leczenia Onkologicznego (DiLO). Zgodnie z opracowaniami statystycznymi, przed wprowadzeniem DiLO mediana czasu oczekiwania od podejrzenia nowotworu do rozpoczęcia leczenia wyniosła 11 tygodni. Wprowadzenie reformy pakietu onkologicznego spowodowało skrócenie oczekiwania o 3 dni [7].

Według zaleceń towarzystw onkologicznych czas od pozyskania materiału tkankowego do opracowania wyniku badania molekularnego nie powinien przekraczać 10 dni roboczych. Do tego trzeba doliczyć czas przygotowania materiału przez pracownię patomorfologii, który nie powinien przekraczać 3 dni od momentu otrzymania skierowania [8]. Zatem, pomijając czynności administracyjne, czas ten powinien wynosić około 13 dni roboczych.

Czy skrócenie czasu oczekiwania na wynik badania molekularnego może mieć istotny wpływ na skrócenie czasu od podejrzenia choroby nowotworowej do wdrożenia leczenia?

W tab. 3 przedstawiono wybór metod najczęściej stosowanych w laboratorium biologii molekularnej.

Dokładny opis poszczególnych metod jest dostępny w cytowanych publikacjach: sekwencjonowanie Sangera i Pirosekwencjonowanie [9], Real-time PCR (qPCR) [10], sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) [11, 12].

Zasadniczym problemem w diagnostyce molekularnej jest wieloetapowość procesu. Czynności laboratoryjne niezbędne do identyfikacji mutacji DNA w komórkach nowotworowych w próbce FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded – utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie) na ogół obejmują:

• przygotowanie skrawka z bloczka albo zeskrobanie ze szkiełka,
• deparafinizację,
• lizę,
• izolację i oczyszczanie DNA,
• ilościowe określenie pobranego DNA,
• przeprowadzanie badań mutacji DNA przy użyciu PCR lub NGS.

Całość procesu trwa zazwyczaj, w zależności od metody, od dwóch godzin (Idylla Biocartis) do dziesięciu dni (Ion AmpliSeq Cancer Hotspot) i, w przypadku większości metod, wymaga wielu pomieszczeń o standardzie czystości molekularnej [14]. W przypadku Systemu Idylla wymagane jest tylko jedno pomieszczenie. Automatyzacja procesu, który przebiega w zamkniętym kartridżu, uniemożliwia zanieczyszczenie próbki, co jest niezwykle ważne w przypadku testów opartych na technologii PCR [15].

Zatem poszukując metody skrócenia czasu, należy zastosować najkrótszą, najprostszą, najłatwiejszą w stosowaniu metodę bezpośrednio w laboratorium znajdującym się w miejscu hospitalizacji pacjenta. Pozwoli to uniknąć problemów logistycznych i kompetencyjnych.

Według Matthews i wsp. [16] zastosowanie zamkniętego, w pełni automatycznego analizatora Idylla pozwalającego uzyskać wiarygodny wynik mutacji somatycznej w czasie od 90 do 140 minut umożliwiło skrócenie uzyskania raportu biomarkerów z 61,5 do 4 dni (mediana). Autorzy podkreślają, że w przypadku Systemu Idylla przygotowanie próbki do testu trwa nie dłużej niż 5 minut, a możliwość kontaminacji jest ograniczona do minimum [17]. Co więcej, jest to system doskonale uzupełniający skomplikowane systemy NGS, wymagające dobrej jakości materiału [18].

Wnioski

1. Konieczne jest wielodyscyplinarne podejście do planowania terapii pacjentów onkologicznych.
2. Należy w każdym szpitalu prowadzącym pacjentów onkologicznych maksymalnie uprościć procedury.
3. Najlepszym rozwiązaniem jest przeprowadzenie całego procesu diagnostycznego w ramach jednej organizacji.

Piśmiennictwo

1. Wojciechowska U., Didkowska J.: Zachorowania i zgony na nowotwory złośliwe w Polsce. Krajowy Rejestr Nowotworów, Narodowy Instytut Onkologii im. Marii Skłodowskiej-Curie – Państwowy Instytut Badawczy. http://onkologia.org.pl/raporty/.

2. Załącznik do obwieszczenia Ministra Zdrowia z dnia 18 lutego 2020 roku (poz. 11) w sprawie wykazu refundowanych leków, środków spożywczych specjalnego przeznaczenia żywieniowego oraz wyrobów medycznych.

3. Shepard H.M., Phillips G.L., Thanos C.D. et al.: Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. „Clinical Medicine”, 2017, 17, 3, 220-232.

4. Van Cutsem E.., Cervantes A., Adam R. et al.: ESMO consensus guidelines for the management of patients with metastatic colorectal cancer. „Annals of Oncology”, 2016, 27, 1386-1422.

5. Planchard D., Popat S., Kerr K. et al.: Metastatic non-small cell lung cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. „Annals of Oncology”, 2018, 29, 192-237.

6. Hoffmann M., Leslie L., Jacobs R. et al.: Reducing the Time From Diagnosis to Treatment of Patients With Stage II/III Rectal Cancer at a Large Public Hospital. „Journal of Oncology Practice”, 2016, 12, 2, 257-262.

7. Osowiecka K., Rucińska M., Nawrocki S.: Have actual waiting times been reduced by introducing the DILO reform for cancer patients in Poland? „Nowotwory. J Oncol”, 2017, 67, 168-173.

8. Krawczyk P., Chorostowska-Wynimko J., Dziadziuszko R. i wsp.: Zalecenia metodyczne dotyczące oceny mutacji genu EGFR oraz rearanżacji genu ALK w kwalifikacji chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca do terapii ukierunkowanych molekularnie. „Onkologia w Praktyce Klinicznej” 2014, 10, 3, 131-137.

9. Tsiatis A.C., Norris-Kirby A., Rich R.G. et al.: Comparison of Sanger Sequencing, Pyrosequencing, and Melting Curve Analysis for the Detection of KRAS Mutations Diagnostic and Clinical Implications. „Journal of Molecular Diagnostics”, 2010, 12, 4, 425-432.

10. Valasek M.A., Repa J.J.: The power of real-time PCR. „Adv Physiol Educ”, 2005, 29, 151159.

11. Mardis E.R.: Next-Generation DNA Sequencing Methods. „Annu. Rev. Genomics Hum. Genet.”, 2008, 9, 387-402.

12. Grada A., Weinbrecht K.: Next-Generation Sequencing: Methodology and Application. „Journal of Investigative Dermatology”, 2013, 133, 11, 1-4.

13. Domagała P., Kowalik A.: Badanie molekularnych markerów wykorzystywanych w leczeniu chorych na raka jelita grubego. „Pol J Pathol”, 2014, 65 (4), 59-77.

14. Sherwood J.L., Brown H., Rettino A. et al.: Key differences between 13 KRAS mutation detection technologies and their relevance for clinical practice. „ESMO Open”, 2017, 2.

15. Weyn C., Van Raemdonck S., Dendooven R. et al.: Clinical performance evaluation of a sensitive, rapid low-throughput test for KRAS mutation analysis using formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples. „BMC Cancer”, 2017, 17, 139.

16. Matthews P., Beharry A., Nematollahi M. et al.: Clinical Impact of Rapid Biomarker Testing in Non-Small Cell Lung Cancer in a Community Setting. „Laboratory Investigation”, 2020, 100 (suppl 1), 1802.

17. De Luca C., Gragnano G., Pisapia P. et al.: EGFR mutation detection on lung cancer cytological specimens by the novel fully automated PCR-based Idylla EGFR Mutation Assay. „J Clin Pathol.”, 2017, 70, 4, 295-300.

18. Franczak C., Dubouis L., Gilson P. et al.: Integrated routine workflow using next-generation sequencing and a fully-automated platform for the detection of KRAS, NRAS and BRAF mutations in formalin-fixed paraffin-embedded samples with poor DNA quality in patients with colorectal carcinoma. „PLoS ONE”, 2019, 14, 2.

Tab. 1. Liczba zgonów związanych z rozpoznanymi nowotworami w latach 2007 i 2017. Dziesięć najczęstszych przyczyn zgonu [1]

Tab. 2. Leki refundowane w Polsce i konieczne badania molekularne [2]

Tab. 3. Wybór metod wykorzystywanych w diagnostyce molekularnej w onkologii [13]

Tab. 4. Leki dopuszczone przez FDA (Food and Drug Administration) do stosowania w onkologii