Test immunoenzymatyczny ELISA – zasada działania i optymalizacja reakcji
Technika ELISA jest szeroko wykorzystywana w badaniach biomedycznych, zarówno do celów naukowych, jak i diagnostycznych, gdzie pozostaje popularną metodą analityczną, gdyż uchodzi za szybką, dokładną, łatwą w wykonaniu, możliwą do zautomatyzowania, bezpieczną i stosunkowo tanią.
ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) to immunoenzymatyczny test fazy stałej, służący do wykrywania i ilościowego oznaczania białek zawartych w badanej próbce, takich jak np. przeciwciała czy antygeny o charakterze białkowym [2, 5, 9, 10]. Działanie metody opiera się na tworzeniu wiązań pomiędzy antygenem a przeciwciałem, które uwidacznia reakcja barwna, zachodząca dzięki skoniugowanym z immunoglobulinami enzymom i odpowiednich dla nich substratom. Nasilenie barwy zależy od ilości powstałych wiązań antygen-przeciwciało i mierzone jest najczęściej kolorymetrycznie przy użyciu spektrofotometru [1, 2, 10].
Metoda po raz pierwszy oficjalnie została opisana w 1971 r. przez Evę Engvall i Petera Perlmanna, którzy wykorzystali przeciwciała znakowane enzymem do ilościowego oznaczania immunoglobulin klasy IgG [3]. Obecnie technika ELISA jest szeroko wykorzystywana w badaniach biomedycznych, zarówno do celów naukowych, jak i diagnostycznych, gdzie pozostaje popularną metodą analityczną, gdyż uchodzi za szybką, dokładną, łatwą w wykonaniu, możliwą do zautomatyzowania, bezpieczną i stosunkowo tanią [2, 6, 10]. Głównym problemem metody jest brak jednej uniwersalnej procedury, która sprawdzałaby się w badaniach materiału różnego rodzaju. Wszystkie parametry, które mają istotne znaczenie dla prawidłowego przebiegu testu, są wysoce swoiste i silnie zależą od stosowanych reagentów. Dlatego przed każdym doświadczeniem wykorzystującym technikę ELISA wymagane jest przeprowadzenie optymalizacji tychże parametrów [2, 9].
Cztery warianty ELISA
Wyróżnia się cztery podstawowe odmiany testu ELISA (rys. 1): bezpośrednią (ang. direct ELISA), pośrednią (ang. indirect ELISA), kanapkową (ang. sandwich ELISA) oraz konkurencyjną (ang. competitive ELISA) [1, 10]. Odmiana kanapkowa może występować w dwóch wariantach: bezpośrednim i pośrednim [1, 2]. Wymienione testy różnią się sposobem ich przeprowadzania (tab. 1) oraz zastosowaniem, a dobór odpowiedniej metody zależy od badanego materiału. Do pomiaru stężenia antygenu służą odmiany: kanapkowa oraz kompetytywna, natomiast w celu ilościowego oznaczania przeciwciał powinno się przeprowadzać test bezpośredni lub pośredni [6].
Test bezpośredni (rys. 1A) jest formatem najszybszym i najprostszym [2, 4]. W tej odmianie procedurę rozpoczyna się od opłaszczenia płytki antygenem. Następnie przeprowadza się inkubację z przeciwciałem pierwszorzędowym, skoniugowanym z enzymem. Po dodaniu odpowiedniego substratu enzym zawarty w koniugacie katalizuje reakcję, której produkt wykrywa się spektrofotometrycznie, a więc ocenia się intensywność barwy [1, 4, 10]. Nie używa się w tej technice przeciwciał drugorzędowych, co znacznie przyśpiesza procedurę, a także eliminuje ryzyko wystąpienia reakcji krzyżowych z udziałem przeciwciał [1, 9]. Za niewątpliwą wadę wariantu bezpośredniego należy uznać niską dostępność na rynku przeciwciał znakowanych enzymem, swoistych dla mało popularnych antygenów. Często wiąże się to więc z koniecznością samodzielnej preparatyki takich koniugatów, co jest bardzo czasochłonne [1]. Metoda ta dobrze sprawdza się do ilościowego oznaczania białek wcześniej wyizolowanych z materiału biologicznego. Do pomiaru stężenia jednego spośród wielu białek złożonej mieszaniny test bezpośredni może okazać się niedostatecznie czuły i swoisty [4, 9]. W rzadkich przypadkach podczas immobilizacji białka do fazy stałej może dochodzić do zaburzenia trójwymiarowej struktury, co wpływa na dostępność epitopów [9].
W teście pośrednim (rys. 1B) używa się dwóch rodzajów przeciwciał detekcyjnych: pierwszorzędowego, skierowanego przeciw badanemu antygenowi opłaszczającemu płytkę, oraz drugorzędowego, skoniugowanego z enzymem i skierowanego przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu [2, 4]. Znakowane przeciwciała nie muszą być więc specyficzne względem antygenu, a jedynie względem przeciwciał pierwszorzędowych, co generuje mniejsze koszty i powoduje, że mogą być wykorzystywane do badań nad wieloma różnymi materiałami biologicznymi. Oprócz tego test pośredni charakteryzuje się większą czułością aniżeli test bezpośredni. Z drugiej strony jest on bardziej czasochłonny, a stosowanie drugiej warstwy przeciwciał może prowadzić do powstawania reakcji krzyżowych [1, 10]. Zarówno testu bezpośredniego, jak i pośredniego najczęściej używa się do oznaczania ilości przeciwciał i badania intensywności odpowiedzi immunologicznej na różnego typu antygeny [6].
Procedurę testu kanapkowego, w odróżnieniu od dwóch wariantów opisanych powyżej, rozpoczyna się od opłaszczenia fazy stałej warstwą przeciwciał pierwszorzędowych. Dopiero po ich związaniu z powierzchnią płytki nanosi się próbę badaną, spośród której wychwytywane są tylko te białka, przeciw którym skierowane są unieruchomione immunoglobuliny. Skutkuje to wyeliminowaniem zjawiska konkurencji oznaczanego antygenu o miejsca wiążące na przeciwciałach z innymi cząsteczkami obecnymi w badanym materiale, co przekłada się na większą specyficzność testu [4, 7]. W zależności od potrzeb, w kolejnych krokach można zastosować wariant bezpośredni (rys. 1C), tylko z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi enzymem, lub wariant pośredni (rys. 1D), w którym dodatkowo używa się warstwy detekcyjnych przeciwciał pierwszorzędowych skierowanych przeciw oznaczanemu antygenowi [1, 7]. Próba z wykorzystaniem przeciwciał wychwytujących i detekcyjnych znajduje szerokie zastosowanie do wykrywania i ilościowego oznaczania białek z dużą ilością epitopów, takich jak cytokiny [6]. Jest również najlepszym rozwiązaniem w badaniach, w których analit jest jednym z wielu rodzajów cząsteczek obecnych w analizowanej próbie. Z bogatej mieszaniny antygenów bowiem na płytce pozostają tylko te, które zostaną rozpoznane przez specyficzne przeciwciała związane już z podłożem [7, 9]. Często wymagane jest użycie dwóch rodzajów przeciwciał, które reagują z różnymi epitopami, jednak jeśli cząsteczka posiada wiele powtarzających się epitopów, możliwe jest użycie tego samego przeciwciała pełniącego funkcję wychwytującą i detekcyjną [6, 7, 9]. Tak postępuje się w przypadku wykrywania obecności całych mikroorganizmów, np. bakterii [6]. Zastosowanie testu kanapkowego skutkuje 3-5-krotnym (a nawet większym) wzrostem czułości w stosunku do standardowych testów bez użycia przeciwciał opłaszczających [7]. Wysoka czułość i stosunkowa prostota bezpośredniego testu kanapkowego powoduje, że jest on najpowszechniej stosowany przez diagnostów i naukowców. Odmiana pośrednia, sandwich ELISA, jest natomiast uznawana za najczulszą i najbardziej specyficzną, choć jednocześnie jej przeprowadzenie wymaga najwięcej czasu [4].
W odmianie konkurencyjnej testu ELISA (rys. 1E) fazę stałą również opłaszcza się przeciwciałami. W przeciwieństwie do pozostałych wariantów, w tym stosuje się znakowane antygeny, które rywalizują o miejsca wiążące w immunoglobulinach z białkami obecnymi w próbie. Uzyskany sygnał zależy więc od proporcji obu rodzajów konkurujących ze sobą cząsteczek i jest tym większy, im mniejsze jest stężenie antygenów znajdujących się w badanym materiale. Wariant kompetytywny stosowany jest do ilościowego oznaczania małych cząsteczek, które nie mają zdolności do wiązania się jednocześnie z dwoma rodzajami przeciwciał [4]. Z uwagi na niewielkie rozmiary badanych antygenów, ich bezpośrednie wiązanie do fazy stałej może być nieefektywne. Co więcej, istnieje możliwość zamaskowania epitopów tych białek przez cząsteczki obecne w roztworze blokującym. Dlatego do wykrywania i ilościowego oznaczania małych białek najlepiej sprawdza się ELISA konkurująca [6]. Testy tego rodzaju znajdują zastosowanie w laboratoriach zajmujących się kontrolą antydopingową w sporcie, gdzie wykorzystuje się je m.in. do pomiaru stężenia hormonów steroidowych i obecności pozostałości lub metabolitów leków, używek czy suplementów [4].
Zasady optymalizacji metody
W celu ustalenia odpowiednich stężeń wszystkich elementów testu ELISA konieczne jest przeprowadzenie różnych układów doświadczeń, w których jedne z reagentów występują w stałym stężeniu, podczas gdy inne są rozcieńczane. Rozkład studzienek na mikropłytce umożliwia nanoszenie kolejnych prób o coraz mniejszej koncentracji optymalizowanych czynników jednocześnie rzędowo i kolumnowo. W ten sposób otrzymuje się na podłożu tzw. szachownicę rozcieńczeń (rys. 2). Pożądanym efektem, widocznym gołym okiem, jest uzyskanie najciemniejszej barwy w lewym górnym rogu płytki (A1), gdzie dodaje się oba testowane elementy układu w najwyższym stężeniu, oraz jaśniejącej w każdym kolejnym dołku (na prawo i w dół), związanej z kolejnymi, coraz większymi rozcieńczeniami reagentów. Ostatni rząd i ostatnią kolumnę za każdym razem powinna stanowić próba ślepa, w której zamiast rozcieńczanego, odpowiednio rzędowo i kolumnowo czynnika, dodaje się sam rozcieńczalnik (oraz pozostałe elementy układu w odpowiednich stężeniach) [2, 9, 10].
W zależności od stosowanego formatu ELISA optymalizacja metody jest mniej lub bardziej skomplikowana. W przypadku testu bezpośredniego wystarczy przetestować tylko jedną wersję, w której ustala się odpowiednie stężenia antygenu oraz znakowanych przeciwciał. Odmianą najbardziej problematyczną do optymalizacji i wymagającą najwięcej pracy jest pośrednia ELISA kanapkowa, w której należy dobrać stężenia aż czterech czynników: pierwszorzędowego przeciwciała wychwytującego, którym opłaszcza się fazę stałą badanej próby, pierwszorzędowego przeciwciała detekcyjnego rozpoznającego antygen oraz drugorzędowego przeciwciała skoniugowanego z enzymem i skierowanego przeciw pierwszorzędowemu przeciwciału detekcyjnemu [2, 9].
Zazwyczaj roztwory decydujących elementów układu (przeciwciała i antygeny) nanosi się w objętości 50 lub 100 μl do każdego dołka. W celu zoptymalizowania stężenia antygenu w tradycyjnej odmianie bezpośredniej lub pośredniej zaleca się wykonanie szeregu około dziesięciu rozcieńczeń dwukrotnych, rozpoczynając od rozcieńczenia 1:10-1:20 [2]. Natomiast w procesie optymalizacji stężeń przeciwciał stosowanych w odmianie kanapkowej bezpośredniej testu powinno się wykonać szeregi rozcieńczeń dwukrotnych obejmujących stężenia 1-15 μg/mL dla przeciwciał wychwytujących oraz 10-500 ng/mL dla przeciwciał detekcyjnych [6]. W wariancie pośrednim, w którym stosuje się dodatkową warstwę przeciwciał detekcyjnych, dobrze, gdy weryfikowane stężenia tych reagentów są około dwukrotnie mniejsze od stężeń przeciwciał wychwytujących [9].
Prawidłowo zoptymalizowany układ powinien charakteryzować się absorbancją na poziomie około 1,5-1,7 [2]. Wartość absorbancji dla próby ślepej nie powinna przekraczać 0,1‑0,2. Czynnikami, które mogą istotnie wpływać na zbyt wyraźne tło reakcji, są m.in.: roztwór blokujący, stężenia przeciwciał wychwytujących i detekcyjnych, warunki inkubacji, stosowane rozcieńczalniki oraz technika płukania [2, 8]. Spotyka się wiele problemów podczas dostosowywania idealnych warunków testu dla badanego materiału (tab. 2). Wystąpienie jakiejkolwiek nieprawidłowości musi zostać dokładnie przeanalizowane, aby poznać jej przyczynę i móc ją skutecznie wyeliminować [1, 2, 5, 6, 8, 9].
Eksperyment własny – Sandwich ELISA
Celem przeprowadzanego doświadczenia była optymalizacja stężeń pierwszorzędowego przeciwciała wychwytującego oraz drugorzędowego przeciwciała detekcyjnego znakowanego enzymem, w teście ELISA (odmiana kanapkowa pośrednia). Układ doświadczalny (rys. 3) składał się z:
– poliklonalnych przeciwciał króliczych skierowanych przeciwko ludzkiemu białku C3c – odczynnik stanowiła oczyszczona frakcja globulinowa surowicy króliczej o stężeniu białka 9,4 g/L (przeciwciała wykorzystano zarówno jako pierwszorzędowe przeciwciało wychwytujące (Ab-I (1)), jak i pierwszorzędowe przeciwciało detekcyjne (Ab-I (2)));
– surowiczej albuminy wołowej (BSA), wykorzystywanej jako czynnik blokujący;
– surowicy ludzkiej, w której wykrywano obecność białka układu dopełniacza C3;
– poliklonalnych kozich przeciwciał skierowanych przeciwko króliczym przeciwciałom koniugowanych z peroksydazą chrzanową (HRP) – odczynnik stanowiło selektywnie wyizolowane przeciwciało sprzężone z peroksydazą, o stężeniu przeciwciała 0,30 g/L, przeciwciała wykorzystano jako przeciwciała drugorzędowe (Ab-II);
– TMB (3,3’,5,5’-tetrametylobenzydyna), wykorzystano jako substrat reakcji katalizowanej przez HRP.
Przeprowadzona próba skutkowała pożądanym efektem barwnym, zróżnicowanym pomiędzy kolumnami i rzędami (fot. 1).
Gradient uzyskany w poziomie odzwierciedla zmiany stężenia Ab-I (1). Do pierwszej kolumny naniesiono najbardziej skoncentrowany roztwór przeciwciał, o stężeniu białka 18,8 µg/mL. Każda kolejna kolumna, do jedenastej włącznie, zawierała roztwór rozcieńczony dwukrotnie w stosunku do kolumny poprzedzającej. Skutkiem szeregu rozcieńczeń w kolumnie 11 uzyskano stężenie Ab-I (1) równe 0,018 μg/mL. Intensywność barwy w pionie zależała natomiast od stężenia Ab-II. Przetestowano sygnał dla szeregu dwukrotnych rozcieńczeń o stężeniu białka z zakresu 600-9,375 ng/mL. Ostatnią kolumnę oraz ostatni rząd stanowiła próba ślepa. Dla najwyższych stężeń Ab-I (1) gradient jest najmniej wyraźny. Potwierdzają to wyniki pomiaru absorbancji (tab. 2). Wartości w kolumnach 1-4 dla każdego rzędu z osobna są bardzo podobne. W kolumnie 5 dla większości rzędów nastąpił pierwszy nieznaczny spadek wartości, które malały konsekwentnie wraz z każdą kolejną kolumną.
Brak różnic pomiędzy początkowymi kolumnami wynika z zastosowania Ab-I (1) w nadmiarze. Uzyskany efekt jest prawidłowy i pożądany w procesie optymalizacji. Oznacza, że stosowanie Ab-I (1) w stężeniach 2,35 μg/mL i wyższych powoduje maksymalne wysycenie dołków przeciwciałami – z uwagi na ograniczoną powierzchnię podłoża nie dochodzi do adsorpcji wszystkich immunoglobulin znajdujących się w próbce. Sekwencję podobnych wartości związanych z taką samą mocą sygnału nazywa się fazą plateau [2], którą obrazuje rejon uwypuklenia krzywych na wykresie (rys. 4).
Optymalne stężenie białka opłaszczającego powinno być nieco niższe od stężenia potrzebnego do pełnego pokrycia dołków płytki. Zbyt gęste upakowanie przeciwciał wychwytujących może powodować nakładanie się na siebie cząsteczek antygenu, zamaskowanie epitopów na ich powierzchni, ograniczając dostępność dla ligandów i uniemożliwiając ich przyłączenie [2, 4]. Nieznacznie mniejszą moc sygnału zaobserwowano przy stężeniu 1,175 μg/mL (kolumna 5), natomiast od stężenia dwukrotnie niższego różnice w sygnale były już bardziej zauważalne. Niższe wartości absorbancji wynikają z niecałkowitego, a w większych rozcieńczeniach – niedostatecznego – wysycenia dołków. Zastosowanie w doświadczeniu zbyt niskiego stężenia czynnika opłaszczającego skutkowałoby obniżonym sygnałem i mniejszą czułością testu [2, 8].
Wartości w kolumnie 12, w której nie znajdowały się przeciwciała wychwytujące, były na jednakowym, niskim poziomie, nie przekraczającym wartości 0,2. Oznacza to, że nie zachodziły żadne reakcje pomiędzy koniugatem a pozostałymi składnikami układu [2].
Pożądane wartości absorbancji w fazie plateau (ok. 1,5-1,7) uzyskano dla stężenia Ab-II wynoszącego 75 ng/mL (rząd D). Sygnał na takim poziomie charakteryzuje układy w pełni sterowalne i daje podstawę do wykonania właściwych analiz i badania określonych zależności [2]. Trzy pierwsze rozcieńczenia charakteryzowały się zbyt silnym sygnałem dla najwyższych stężeń Ab-I (1) – wartości absorbancji wyniosły ponad 1,9 – co prawdopodobnie oznacza, że doszło do niespecyficznych wiązań z udziałem Ab-II. Natomiast stężenia mniejsze niż 75 ng/mL skutkowały znacznym spadkiem uzyskanego sygnału, co z kolei może znacząco obniżać czułość testu związaną ze zdolnością do wykrywania antygenu. W docelowych badaniach powinno się unikać stosowania zarówno nadmiaru, jak i zbyt małej ilości Ab-II [2].
Odpowiednie stężenie koniugatu jest czynnikiem mającym bezpośredni wpływ na intensywność generowanego sygnału – od ilości enzymu zależy wydajność reakcji. Odchylenia od optymalnego stężenia koniugatu mogą skutkować niepożądanym zjawiskiem, jakim jest niewielka różnica pomiędzy sygnałem rzeczywistym, związanym z obecnością wykrywanego materiału, a sygnałem powstającym w tle reakcji (tzw. szum) [2, 9].
Na podstawie uzyskanych wyników przeprowadzonej optymalizacji za odpowiednie stężenie pierwszorzędowego przeciwciała wychwytującego można więc uznać 1,175 μg/mL. W stężeniu tym immunoglobuliny nie wysycały maksymalnie podłoża, pozostawiając większą „swobodę” antygenom, które wiążąc się do warstwy opłaszczającej, nie maskowały wzajemnie swoich epitopów. Jednocześnie, stosując takie stężenie, na podłożu nie pozostało zbyt wiele niezwiązanych miejsc, co z kolei mogłoby skutkować niespecyficznymi wiązaniami innych składników bezpośrednio do płytki.
Przy tak dobranych warunkach doświadczenia jako optymalne stężenie drugorzędowego przeciwciała detekcyjnego skoniugowanego z enzymem można uznać 75 ng/mL, w którym nasilenie barwy i moc sygnału były na pożądanym poziomie, a jednocześnie nie doszło do niespecyficznych wiązań koniugatów, na co wskazują uzyskane wartości na poziomie 0,1 dla prób ślepych.
Powyższy opis dotyczy optymalizacji dla dwóch składników układu: pierwszorzędowego przeciwciała wychwytującego oraz drugorzędowego przeciwciała znakowanego enzymem. Analogicznie podobną procedurę można przeprowadzić dla pozostałych komponentów: antygenu i pierwszorzędowego przeciwciała detekcyjnego. Po pełnej analizie wszystkich składników układu możliwe jest ustalenie stężeń optymalnych dla danego modelu doświadczalnego.
Podsumowanie
ELISA jest podstawowym testem służącym do jakościowego i ilościowego oznaczania białka w badanej próbie, opartym na ilości tworzących się wiązań antygen-przeciwciało. Znane są różne modyfikacje techniki, których wybór zależy od rodzaju analizowanego materiału oraz celu doświadczenia. Niezależnie od wariantu przed rozpoczęciem badań należy przeprowadzić optymalizację metody, polegającą na ustaleniu odpowiednich stężeń wszystkich elementów układu. Przy użyciu 96-dołkowej mikropłytki tworzy się tzw. szachownicę rozcieńczeń, obejmującą gradienty stężeń dwóch optymalizowanych czynników. Następnie dokonuje się odczytu spektrofotometrycznego i analizy uzyskanych wartości absorbancji. Proces optymalizacji jest konieczny, gdyż nieprawidłowe dobranie stężeń przeciwciał i antygenu może prowadzić do wystąpienia niepożądanych interakcji i w znaczący sposób wpływać na jakość przeprowadzanego testu, zmniejszając jego czułość i specyficzność.
