Dla każdego chemika analityka, jak również diagnosty laboratoryjnego, celem jest oznaczenie stężenia analitu z jak największą czułością oraz dokładnością. Zadanie jest o tyle trudne, że w przypadku próbek klinicznych poszukiwany analit (lub anality), maskowany jest przez składniki skomplikowanych matryc – płynów ustrojowych, takich jak krew pełna, surowica, osocze lub mocz. Nierzadko poszukiwany związek jest chemicznie podobny do innych składowych matrycy. Na przestrzeni lat zostały rozwinięte metody, które z założenia miały sprostać postawionemu celowi, a w efekcie pozwolić na uzyskanie pewnego i wiarygodnego wyniku. Diagnostyka laboratoryjna postawiła jeszcze jedno wyzwanie: metody mają być proste w wykonaniu, a ich koszt relatywnie niski, aby zapewnić dostęp do analiz każdemu pacjentowi objętemu systemem ubezpieczeń zdrowotnych. Kryteria te powodują, że osiągnięcie celu nie jest proste, a producenci są zmuszeni do ciągłego doskonalenia istniejących metod oraz poszukiwania nowych rozwiązań technicznych. Obszar ten stanowi duże pole do działania dla innowacyjnych rozwiązań oferowanych przez nowych graczy na rynku. Bez wątpienia po zakończeniu pierwszego etapu, opartego na metodach z detekcją kolorymetryczną oraz w czasie trwającego drugiego etapu, opartego o techniki immunoenzymatyczne, trzeci etap będzie należał do spektrometrii mas. Dla potrzeb niniejszego artykułu oraz zapewnienia jego przejrzystości autorzy przyjęli pewne uproszczenia będące ich własnym poglądem, ale opartym na wiedzy merytorycznej i technicznej zdobytej w ciągu kilku lat pracy zawodowej.

Metody diagnostyki laboratoryjnej

Na przestrzeni kilkudziesięciu lat powstał szereg metod analitycznych, które do chwili obecnej funkcjonują w rutynowych laboratoriach medycznych na całym świecie. Można w skrócie podzielić je na trzy grupy:
I)    metody wykorzystujące reakcje barwne (w tym enzymatyczne) i detekcję fotometryczną. Stanowią one dziś większość spośród metod wykorzystywanych rutynowo;
II)    metody powstałe w drugiej połowie lat siedemdziesiątych XX w. i później, bazujące na reakcjach immunoenzymatycznych, charakteryzujące się wysoką czułością oraz wyższą swoistością niż opisana pierwsza grupa metod;
III)    metody oparte na spektrometrii masy sprzężonej z wysokosprawną chromatografią cieczową. To stosunkowo nowość na polu diagnostycznym, ponieważ ich rozwój rozpoczął się pod koniec XX w.
Te trzy grupy metod będą stanowiły podstawę dalszych rozważań w zakresie ich wad i zalet oraz perspektyw wykorzystywania w przyszłości.
Metody immunoenzymatyczne (EIA, ang. enzymatic immunoassay) cechuje mała swoistość i brak możliwości rozróżniania konformacji sferycznych. Bardzo dobrym przykładem może być oznaczanie stężenia witaminy D2/D3 oraz epimeru trzeciego witaminy D3.
Analizując wzory strukturalne, niełatwo zauważyć różnicę w strukturach pierścieni kalcyferolu i cholokalcyferolu. Natomiast witamina D3 od epimeru trzeciego różni się tylko ułożeniem grupy hydroksylowej w przestrzeni. Ta izomeria wiąże się ze znaczącą różnicą w aktywności biologicznej obu form (rys. 1).
Podobnym przykładem może być cyklobenzaprin, którego struktura jest podobna do naturalnie występującej aminotryptyliny (rys. 2).
Podobieństwo struktur nie pozwala na uzyskanie wiarygodnego wyniku, stosując zestawy odczynnikowe oparte na zasadzie immunochemicznej.
Niedoskonałość metod immunochemicznych, w odniesieniu do oznaczenia analitów niewiele różniących się od siebie, wynika z technologii produkcji przeciwciał, stanowiących podstawę zestawów do oznaczeń immunochemicznych. Można już dziś zaryzykować stwierdzenie, że jest to ślepa droga, która może prowadzić do uzyskania zafałszowanych wyników. Poza ograniczeniami swoistości, drugim poważnym problemem są interferencje, które w naszej ocenie stawiają duży znak zapytania co do celowości stosowania metod immunochemicznych w wielu badaniach rutynowych.
Wad powyższych dwóch grup metod są pozbawiane rozwiązania wykorzystujące spektrometrię mas, a dokładnie spektrometry z analizatorem typu potrójny kwadrupol, które są idealnym narzędziem dla oznaczeń ilościowych.

Chromatografia cieczowa

Najczęściej wykorzystywane spektrometry mas do diagnostyki laboratoryjnej są sprzężone z wysokosprawnym zestawem chromatografii cieczowej − HPLC. Sama metoda rozdzielania chromatograficznego jest znana od ponad 100 lat. W 1905 r. rosyjski uczony Michaił Cwiet opublikował pierwsze prace dotyczące rozdzielenia barwników roślinnych. Przez kolejne lata technikę chromatografii udoskonalano poprzez rozwój części sprzętowej oraz kolumn chromatograficznych, a także przez tworzenie nowych aplikacji. Już w połowie XX w. zaczęto stosować zestawy chromatografii cieczowej do rutynowych analiz w zakresie chemii klinicznej. Niestety skomplikowanie zestawów chromatograficznych, w porównaniu z dedykowanymi analizatorami biochemicznymi i immunologicznymi, spowodowały, że chromatografia cieczowa nie stała się popularnym narzędziem w rękach diagnostów. Raczej okazała się techniką niszową w nielicznych ośrodkach, gdzie jej stosowanie było i jest konieczne do uzyskania wiarygodnych wyników laboratoryjnych. Najczęściej spotykanymi aplikacjami dla chromatografii cieczowej są oznaczanie amin biogennych, homocysteiny, niektórych witamin oraz terapia monitorowana wybranych leków. Największymi ograniczeniami dla powszechnego stosowania chromatografii cieczowej w pracy rutynowej są nieco skomplikowana obsługa zestawu oraz konieczność wykonania dobrego rozdziału chromatograficznego, co pozwoli na uniknięcie interferencji. Kolejnymi problemami są też konieczność stosowania różnych detektorów oraz czasem ich niestabilna praca (jak np. w przypadku detektora elektrochemicznego). To wszystko powoduje niechęć diagnostów do tej metodyki, co skutkuje jej małą popularnością. Idealnymi rozwiązaniami byłyby uniwersalny detektor i bardzo prosty chromatograf cieczowy.

Spektometria mas

Na początku XX w. Joseph J. Thomson opracował pierwszy spektrometr mas, który daleki był od urządzeń, które znamy ze współczesnych laboratoriów. Podobnie jak w przypadku chromatografii cieczowej, przez ostatnie nieco ponad 100 lat w spektometrii mas nastąpił nieprawdopodobny rozwój zarówno od strony technicznej, jak i aplikacyjnej. Współczesne rozwiązania stały się urządzeniami zapewniającymi wysoką czułość, selektywność, a jednocześnie spektrometry mas stały się prostsze w obsłudze i wręcz niezawodne. Spośród szerokiej gamy dostępnych spektrometrów w rutynowej diagnostyce laboratoryjnej zastosowanie znalazło rozwiązanie określane popularnie jako spektrometr mas – potrójny kwadrupol. Jest to zdecydowanie najczęściej stosowany spektrometr, który można zaryzykować nazwania standardem.
Każdy zestaw do spektrometrii mas składa się z trzech elementów: (1) układu wprowadzania próbki, (2) analizatora mas oraz (3) oprogramowania sterującego pracą zestawu. Najczęściej przygotowaną próbkę do analizatora mas wprowadza się za pomocą chromatografu cieczowego, co wynika z dużej popularności oraz dostępności metod bazujących na rozdzielaniu chromatograficznym. Jedyną wadą tego rozwiązania jest relatywnie długi czas rozdzielania próbki, co skutkuje mniejszą wydajnością zestawu (ilość wykonanych analiz w ciągu godziny). Najnowsze trendy zmierzają w kierunku systemów wprowadzania próbki do analizatora mas bez etapu chromatografii, co znacząco skraca czas analizy oraz upraszcza samą metodę.  Umożliwia jednocześnie automatyzację procesu przygotowania próbki.
Analizator mas, czyli moduł spektrometru, składa się z trzech elementów:
•    źródła jonów – najistotniejszy element, ponieważ praca każdego następnego modułu zależy od efektywności procesu jonizacji. Zarówno optyka jonowa, jak i detektor mogą analizować jedynie jony. Cząsteczki obojętne są dla nich „niewidoczne”. Do źródła jonów jest wprowadzana próbka, w przypadku wykorzystania chromatografu cieczowego, w postaci cieczy. Zadaniem źródła jest jonizacja analitów zawartych w próbce oraz zamiana stanu ciekłego w gazowy. Najbardziej popularne jest źródło typu ESI (ang. electrospray ionization), które wykorzystuje zjawisko elektrorozpraszania;
•    optyka jonowa składa się z dwóch analizatorów mas oraz łączącej je komory zderzeń, gdzie dochodzi do fragmentacji jonów pseudomolekularnych, w wyniku czego powstają jony fragmentacyjne. Dzięki trybowi pracy monitorowania wybranych reakcji fragmentacji (MRM, ang. selected reaction monitoring) możliwe są analiza jonów fragmentacyjnych i uzyskanie informacji jakościowej oraz ilościowej o analizowanych związkach chemicznych. Poza trybem pracy MRM istnieje jeszcze kilka innych możliwości pracy spektrometru typu potrójny kwadrupol, ale z punktu przydatności do analiz rutynowych dla uzyskania czułości, jak i selektywności, ten jest najbardziej przydatny.

Praktyczne zastosowania spektrometrii mas w diagnostyce laboratoryjnej

Opisane powyżej zalety spektrometru mas typu potrójny kwadrupol powodują, że jest on idealnym narzędziem w szerokim zakresie aplikacji, które pozwala na uzyskiwanie wiarygodnych wyników w krótkim czasie, a koszty analiz są bardzo konkurencyjne dla powszechnie stosowanych metod immunochemicznych.
Do najczęściej wykonywanych oznaczeń można zaliczyć:
•    badanie przesiewowe noworodków w kierunku zaburzeń metabolicznych;
•    oznaczanie hormonów sterydowych;
•    oznaczanie leków immunuspresyjnych i kwasu mykofenolowego;
•    terapię monitorowaną leków;
•    oznaczanie witaminy D2/D3;
•    profil amin biogennych.

Podsumowanie

Spektrometria mas znalazła miejsce w rutynowej diagnostyce laboratoryjnej, choć w Polsce są to dopiero początki. Metoda ta zapewnia unikalną czułość i selektywność analiz. Doskonale sprawdza się w przypadku oznaczeń mniej typowych analitów, gdzie jeszcze nie opracowano zestawów odczynnikowych bazujących na typowych reakcjach immunochemicznych. Zalety tej techniki są niepodważalne i logiczna staje się coraz większa obecność spektrometrów mas w medycznych laboratoriach diagnostycznych.