fot. iStock

TITLE: Review of detected mechanisms of resistance in bacteria

STRESZCZENIE: Dynamiczny rozwój antybiotykoterapii doprowadził do powstania wielu mechanizmów oporności u bakterii. Wykrywanie mechanizmów oporności w laboratoriach mikrobiologicznych jest obecnie koniecznym obowiązkiem służącym doborowi odpowiedniego leku w zakażeniach bakteryjnych. Wszystkie laboratoria mikrobiologiczne na terenie Europy, w tym Polski, zostały zobligowane do wprowadzania i stosowania zaleceń Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości EUCAST.

SŁOWA KLUCZOWE: mechanizmy oporności, antybiotykoterapia, bakterie, EUCAST

SUMMARY: The dynamic development of antibiotic therapy has led to the creation of many mechanisms of resistance in bacteria. The detection of resistance mechanisms in microbiological laboratories is now a necessary duty in order to select the right drug for bacterial infections.
All microbiological laboratories in Europe, including Poland, have been obliged to implement and apply the recommendations of the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing.

KEYWORDS: mechanisms of resistance, antibiotic therapy, bacteria, EUCAST

Na przestrzeni wieków epidemie oraz wszelkiego rodzaju zakażenia dziesiątkowały ludzkość, która toczyła nierówną walkę z drobnoustrojami, ponieważ nie znano przyczyn wywołujących choroby ani skutecznych leków. Rozwój chemioterapii zaczął się dopiero od czasów Paula Echrlicha, który pierwszy sformułował podstawy toksyczności wybiórczej, poznał powstawanie zjawiska lekooporności i rolę leczenia skojarzonego w walce z opornością. Współczesna era szybkiego rozwoju chemioterapii zaczęła się w 1935 roku wraz z odkryciem sulfonamidów przez Gerharda Domagka. Pięć lat później Chain i Florey wykazali, że odkryta w 1929 roku przez Fleminga penicylina może być zastosowana jako skuteczny lek chemioterapeutyczny [1]. W ciągu kolejnych 25 lat badania koncentrowały się na substancjach przeciwbakteryjnych wytwarzanych przez drobnoustroje, nazwanych antybiotykami. Kiedy w latach czterdziestych i pięćdziesiątych wprowadzono je po raz pierwszy do lecznictwa, oczekiwano, że całkowicie zlikwidują one choroby zakaźne. Szybko stało się jednak oczywiste, że oporność pewnych bakterii na niektóre grupy antybiotyków jest ich stałą wrodzoną cechą, którą przewidział sir Almorth Wright zaraz po odkryciu penicyliny [2, 3]. Obecnie wiadomo, że proces ten jest możliwy dzięki trzem mechanizmom: koniugacji, transformacji i transdukcji. Oporność drobnoustrojów na antybiotyki jest determinowana informacją genetyczną zakodowaną w chromosomie lub na elementach ruchomych, jak: plazmidy, transpozony lub integrony. O oporności drobnoustrojów na antybiotyk mówi się wtedy, kiedy średnie stężenia hamujące populację drobnoustrojów in vitro są większe od stężeń możliwych do uzyskania in vivo. Istnieją dwa rodzaje oporności bakterii na antybiotyki. To oporność naturalna oraz nabyta. Oporność naturalna (oporność własna) w przeciwieństwie do oporności nabytej i/lub mutacyjnej jest charakterystyczna dla wszystkich lub niemal wszystkich izolatów danego gatunku bakterii. Oporność naturalna na lek oznacza, że aktywność przeciwbakteryjna leku jest klinicznie niewystarczająca lub oporność na lek jest wrodzona, co powoduje, że lek jest klinicznie bezużyteczny. Oznaczanie wrażliwości na taki lek jest niepotrzebne, aczkolwiek może być wykonane, jeśli lek wchodzi w skład stosowanego rutynowo panelu antybiotyków. Wynik „wrażliwy” otrzymany w oznaczeniu lekowrażliwości u gatunków z naturalną opornością należy traktować z ostrożnością, gdyż oznacza on najprawdopodobniej błąd identyfikacji lub błąd oznaczenia lekowrażliwości. Nawet w przypadku potwierdzenia wrażliwości najlepiej byłoby nie stosować takiego leku lub jeśli nie ma innego wyboru − stosować go z dużą ostrożnością. Większe znaczenie w praktyce ma oporność nabyta, która rozwinęła się w wyniku mutacji lub nabywania obcego DNA (przenoszenie genów oporności), przy początkowej wrażliwości bakterii na dany antybiotyk. W wyniku mutacji spontanicznej, nawet przy braku kontaktu z lekiem, powstaje oporność nabyta pierwotna. Ten typ oporności jest kodowany chromosomalnie. Natomiast oporność nabyta wtórna powstaje w wyniku kontaktu bakterii z antybiotykiem. Mechanizm genetyczny oporności wtórnej, w przeciwieństwie do oporności pierwotnej, jest pozachromosomalny. Za pojawienie się tego zjawiska odpowiedzialne są geny znajdujące się w kolistych fragmentach cząsteczek DNA (plazmidach) [4, 5].

Obecnie wiadomo, że bakterie uzyskują antybiotykooporność przez:

• aktywne usuwanie antybiotyku z komórki,
• modyfikację składników komórki będących celem antybiotyku,
• nadekspresję enzymu inaktywowanego przez antybiotyk,
• modyfikacje enzymatyczne antybiotyku,
• wytwarzanie alternatywnego szlaku metabolicznego,
• zmianę przepuszczalności osłon komórkowych bakterii,
• obniżenie ilości bądź aktywności enzymu aktywującego prekursor antybiotyku,
• zwiększenie stężenia metabolitu będącego antagonistą antybiotyku,
• modyfikację w systemach regulacyjnych niedotyczących bezpośrednio mechanizmu działania antybiotyku, obniżenie zapotrzebowania na produkt hamowanego szlaku metabolicznego [6, 7].

Na przestrzeni osiemdziesięciu lat od momentu wprowadzenia antybiotyków do lecznictwa, wiedza o mechanizmach oporności drobnoustrojów dynamicznie się zmieniała i poszerzała. Pierwszy mechanizm oporności pojawił się w przypadku szczepów Staphylococcus aureus opornych na penicylinę. Wynika on ze zdolności nadprodukcji penicylinaz, które hydrolizują pierścień β-laktamowy. Szacuje się, że 95% szczepów S. aureus występujących obecnie w środowisku szpitalnym na świecie wykazuje oporność na penicylinę [8, 9].

Duże nadzieje wiązano z wprowadzoną w 1956 r. wankomycyną oraz w 1978 r. teikoplaniną. Bakteriobójcze działanie antybiotyków glikopeptydowych, podobnie jak β-laktamów, polega na hamowaniu syntezy peptydoglikanu. Proces ten odbywa się poprzez łączenie antybiotyku z bocznymi łańcuchami peptydowymi, co uniemożliwia tworzenie wiązań krzyżowych. Glikopeptydy zaburzają także syntezę RNA i przepuszczalność błony komórkowej. Po wielu latach skutecznego stosowania glikopeptydów, w 1988 r. odnotowano pierwszy szczep oporny na: wysokie stężenie glikopeptydów, wankomycynę i teikoplaninę. Badania prowadzone na szczepach opornych na wankomycynę wykazały, że antybiotyk nie inaktywuje enzymów bakteryjnych, ale wywołuje ekspresję genów odpowiedzialnych za pojawienie się nowych białek. Do mechanizmów oporności nabytej enterokoków zalicza się: oporność na wysokie stężenia antybiotyków aminoglikozydowych HLAR (ang. high-level aminoglikozyde resistance), oporność na glikopeptydy VRE (ang. vancomycin-resistant Enterococcus) oraz oporność na linezolid LRE (ang. linezolid-resistant Enterococcus). Te mechanizmy mają największe znaczenie kliniczne i epidemiologiczne. Pod względem oporności na wankomycynę enterokoki charakteryzują się dużą niejednorodnością zarówno fenotypową, jak i genotypową.

W 1961 roku udało się wytworzyć 7-ACA, a z niego pierwszą cefalosporynę, cefalotynę, wytwarzaną na skalę przemysłową, wprowadzoną w 1964 roku na rynek. Odpowiedzią na wprowadzenie cefalosporyn do lecznictwa było pojawienie się cefalosporynaz. β-laktamazy AmpC są to cefalosporynazy o zróżnicowanym poziomie aktywności, w zależności od gatunku bakterii. Ze względu na to, że częściowo mogą łączyć się z elementami ściany komórkowej bakterii, przypominają PBP (ang. penicillin-binding proteins). Cefalosporynazy AmpC rozkładają wszystkie penicyliny i cefalosporyny (głównie I i II generacji) z wyjątkiem cefepimu, nie hydrolizują aztreonamu, chociaż niektóre mogą go wiązać. Nie hydrolizują natomiast karbapenemów, nie są również hamowane przez kwas klawulanowy. Cefalosporynazy AmpC wytwarzane są przez bakterie Gram-ujemne, głównie z rodzajów Acinetobacter spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., Escherichia, Klebsiella spp., Serratia spp., Morganella spp., Providencia spp. i Pseudomonas [10, 11].

W 1983 r. w Niemczech wyizolowano po raz pierwszy szczep bakterii (Klebsiella pneumoniae) wytwarzający β-laktamazy o rozszerzonym spektrum działania ESBL (ang. extended-spectrumβ-lactamase). β-laktamazy typu ESBL pojawiły się w odpowiedzi na wprowadzenie oksyimino-ß-laktamów, tj. cefuroksym i cefalosporyny III generacji. β-laktamazy typu ESBL inaktywują penicyliny, cefalosporyny I-III generacji oraz monobaktamy (aztreonam), natomiast wykazują słabą aktywność wobec cefamycyn i nie inaktywują karbapenemów [12].

Od początku lat 90. XX wieku zaobserwowano w wielu krajach szybki wzrost oporności na penicylinę PNSP (ang. penicillin-nonsusceptible pneumococci) i inne ß-laktamy, której dodatkowo często towarzyszy niewrażliwość na inne grupy leków. Oporność na ß-laktamy u S. pneumoniae to wynik wytwarzania zmodyfikowanych białek PBP przez bakterie. Biorą one udział w biosyntezie ściany komórkowej, która jest celem działania tych leków [13, 14, 15].
W połowie lat 90. ubiegłego wieku zidentyfikowano enzymy hydrolizujące szerokie spektrum antybiotyków β-laktamowych, w tym karbapenemy. Enzymy te posiadają w centrum aktywnym jony cynku. Noszą nazwę karbapenemaz MBL (ang. metallo-β-lactamases). Geny kodujące MBL zlokalizowane są w chromosomie lub plazmidach. Sprzyja to łatwemu rozprzestrzenianiu się tych genów w populacji bakterii różnych gatunków, a szczepy wytwarzające MBL (głównie typów IMP oraz VIM) wykrywane są na całym świecie [16, 17].

Pod koniec lat 90. XX w. zidentyfikowano β-laktamazy o aktywności karbapenemaz, które nazwano – KPC (ang. Klebsiella pneumoniae carbapenemase). Po raz pierwszy szczepy wytwarzające β-laktamazy KPC zostały wykryte w USA w 1996 r. i w ciągu zaledwie kilku lat rozprzestrzeniły się one w szpitalach wschodniego wybrzeża tego kraju, wywołując w nich liczne epidemie [18]. Z pewnym opóźnieniem do identycznego zjawiska doszło w Izraelu, gdzie po raz pierwszy szczepy KPC zostały wykryte w 2005 r. [19]. Stanowią one ogromne zagrożenie. Enzymy te hydrolizują: karbapenemy, penicyliny, cefalosporyny oraz aztreonam i są hamowane przez kwas klawulanowy oraz tazobaktam. β-laktamazy typu KPC wykryto w szczepach m.in.: Klebsiella spp., Enterobacter spp., Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa i Serratia spp. [20, 21].

Natomiast pierwszym rodzajem nabytych CHDL (carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamases) obserwowanym tylko u Enterobacterales są enzymy typu OXA-48. β-laktamazę tę zidentyfikowano w 2001 r. w Turcji w Klebsiella pneumoniae, gdzie kilka lat później szczepy OXA-48+ wywołały liczne epidemie szpitalne. Drobnoustroje o takim fenotypie uległy także rozprzestrzenieniu w krajach basenu Morza Śródziemnego oraz Indiach, a także zostały przeniesione do Europy. Głównym producentem β-laktamaz z grupy OXA-48 jest K. pneumoniae, ale obecność tych enzymów stwierdza się także u innych gatunków Enterobacterales, zwłaszcza E. coli i Enterobacter cloacae [22]. Problem narastającej i zmieniającej się w czasie oporności drobnoustrojów nastręczał wielu problemów. Już w latach 60. i 70. XX w. zauważono, że brakuje jakichkolwiek międzynarodowych norm stosowania odpowiednich antybiotyków i określenia stosowanych dawek. Wspominał o tym m.in. Wilhelm Grauer w wydaniu Leczenie antybiotykami z 1971 r. Z biegiem lat sytuacja zaczęła się normalizować i w Polsce w roku 1997 został wdrożony skoordynowany system monitorowania lekooporności. Minister Zdrowia powołał wówczas Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów. W 2000 roku rozpoczął działanie program polityki zdrowotnej OPTY-NEURON-ESAC zajmujący się monitorowaniem sytuacji epidemiologicznej w wybranej grupie szpitali. W ramach tego programu w 2002 roku zaczęto gromadzić informacje na temat konsumpcji leków przeciwbakteryjnych w szpitalach oraz podstawowej opieki medycznej. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego nawiązał współpracę naukową w zakresie międzynarodowych programów finansowych przez Unię Europejską (DG Research, DG – Sanco) m.in.: ESAC, EARSS, SAR, EU-IBOS, EUCAST, IPSE-HELICS, COBRA, AMR, BIOSAFE. W latach 2004-2005 w Polsce nastąpiły korzystne zmiany w systemie organizacji nadzoru epidemiologicznego oraz dostosowanie polskiego prawa do wymagań Unii Europejskiej. Dzięki tym zmianom zostały skonstruowane ramy prawne dla systemu raportowania występowania tzw. patogenów alarmowych w szpitalach. W 2004 roku Minister Zdrowia utworzył program polityki zdrowotnej „Narodowy Program Ochrony Antybiotyków”. Celem planu było zbudowanie w latach 2005-2010 wielosektorowego mechanizmu koordynującego realizację opartej na podstawach naukowych strategii monitorowania i racjonalizacji stosowania antybiotyków w Polsce. Ma on jednocześnie zapewniać wymianę informacji oraz kooperację z Komisją Europejską i pozostałymi krajami członkowskimi [12].

W 2010 r. został powołany przez Konsultanta Krajowego w dziedzinie mikrobiologii lekarskiej prof. dr hab. n. med. Walerię Hryniewicz, Zespół Roboczy ds. wprowadzania zaleceń Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości EUCAST, który zaangażowany był w proces wprowadzania zaleceń EUCAST. Zespół wraz z Konsultantem Krajowym w dziedzinie mikrobiologii oraz z Krajowym Ośrodkiem Referencyjnym ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD) opracował strategię wprowadzenia w Polsce zaleceń EUCAST dotyczących metodyki i interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów. Od 1.04.2011 r. zalecenia stały się obowiązujące we wszystkich medycznych laboratoriach mikrobiologicznych w Polsce. Laboratoria mikrobiologiczne w Polsce zobowiązane są do wykrywania szeregu groźnych mechanizmów lekooporności w szczepach klinicznych drobnoustrojów. Do mechanizmów tych należy między innymi, wytwarzanie różnych rodzajów β-laktamaz przez pałeczki Gram-ujemne (pałeczki z rodz. Enterobacterales i niefermentujące), w tym ESBL, MBL, KPC. W związku ze zjawiskiem szerokiego rozprzestrzeniania się drobnoustrojów ESBL+ wskazane jest wykonanie testu na obecność ESBL wraz z antybiogramem. U Enterobacterales należy wykonywać jednocześnie dwa typy karbapenemaz MBL i KPC u wszystkich izolatów niewrażliwych (średnio wrażliwych i opornych) przynajmniej na jeden karbapenem (imipenem, ertapenem, meropenem, doripenem). W przypadku pałeczek niefermentujących najważniejszym problemem epidemiologicznym jest występowanie karbapenemaz typu MBL. Obecność MBL stwierdza się przede wszystkim u Pseudomonas areuginosa [23]. Laboratoria mikrobiologiczne zobligowane są do wykonywania antybiogramów oraz poniżej podanych mechanizmów oporności. Otrzymane wyniki są interpretowane z zastosowaniem zaleceń eksperckich i zaleceń Zespołu ds. oznaczania lekowrażliwości, zgodnie z zaleceniami EUCAST do interpretacji wyniku badania i przygotowania ostatecznego raportu z badania.

Metoda dyfuzyjno-krążkowa

Metoda Kirby-Bauera jest badaniem wykonywanym rutynowo, pozwala zakwalifikować badany szczep do kategorii drobnoustrojów: wrażliwych, średnio wrażliwych lub opornych na dany antybiotyk. Metoda dyfuzyjno-krążkowa, w której na płytkę agarową nanosi się zawiesinę bakterii w stężeniu 0,5 MacFarlanda i nakłada się krążki bibułowe nasycone antybiotykiem, jest zalecana do badania wrażliwości drobnoustrojów szybko rosnących, kiedy odczyt wyniku następuje po 18 godzinach.

Metoda E-testu

Jest to metoda ilościowo-jakościowa. Oparta jest na dyfuzji antybiotyku zawartego w plastikowym pasku, z którego uwalnia się antybiotyk w postaci gradientu stężeń do podłoża. Po 18-godzinnej inkubacji powstaje strefa zahamowania wzrostu w kształcie elipsy. Granica strefy przecinającej pasek pozwala wyznaczyć MIC.

Oznaczanie ESBL metodą dwóch krążków

Do wykrywania ESBL może być stosowany tzw. test dwóch krążków (DDST). Za jego pomocą ESBL można oznaczać u wszystkich gatunków Enterobacterales, a także pałeczek niefermentujących. W wariancie podstawowym tej metody stosuje się krążki z ceftazydymem i cefotaksymem ułożone w odległości 2 cm (pomiędzy środkami) od krążka z amoksycyliną z kwasem klawulanowym. Wynik pozytywny testu polega na wyraźnym powiększeniu strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z ceftazydymem lub cefotaksymem (cefpodoksymem, aztreonamem) od strony krążka zawierającego kwas klawulanowy. Powiększenie to może przybierać bardzo różne kształty.

Wykrywanie KPC testem fenotypowym z kwasem boronowym

Oznaczenie wykonuje się metodą dyfuzyjno-krążkową zgodnie z metodyką EUCAST, z zastosowaniem dwóch krążków z meropenem. Jeden z nich nasączony jest kwasem fenyloboronowym. W przypadku pałeczek z rodziny Enterobacterales za wynik dodatni przyjmuje się widoczną różnicę (powiększenie) wielkości średnicy strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z meropenemem w stosunku do krążka meropenem + kwas fenyloboronowy o 4 mm lub więcej. W przypadku pałeczek niefermentujących z rodzajów Pseudomonas i Acinetobacter: różnica (powiększenie) wielkości średnicy strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z meropenemem w stosunku do krążka meropenem + kwas fenyloboronowy o 7 mm lub więcej. Wynik dodatni testu sugeruje podejrzenie produkcji KPC.

Wykrywanie MBL
testem fenotypowym z EDTA

Oznaczenie wykonuje się metodą dyfuzyjno-krążkową lub metodą gradientowo-dyfuzyjną zgodnie z metodyką EUCAST. Metoda dyfuzyjno-krążkowa wymaga zastosowania trzech krążków z ceftazydymem i imipenemem, w środku pomiędzy nimi znajduje się krążek nasączony EDTA. Dodatni wynik testu sugeruje pojawienie się i wyraźne powiększenie strefy wokół krążka z ceftazydymem i/lub imipenemem od strony krążka zawierającego EDTA, inhibitora MBL (obraz podobny do dodatniego wyniku oznaczania ESBL metodą dwóch krążków).

Wykrywanie OXA-48
testem z krążkiem z temocyliną 30 μg

Oznaczenie wykonuje się metodą dyfuzyjno-krążkową zgodnie z metodyką EUCAST, z zastosowaniem krążka z temocyliną. Dodatni testu i podejrzenie produkcji OXA-48: średnica strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z temocyliną mniejsza lub równa 10 mm. Izolaty Enterobacterales produkujące karbapenemazę OXA-48 wykazują wysoki poziom oporności na temocylinę (MIC od 128 do > 256 mg/L) oraz oporność na piperacylinę z tazobactamem.

Mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe Staphylococcus spp.

Oznaczanie wrażliwości na meticylinę u wszystkich gatunków gronkowców wykonuje się z użyciem krążka z cefoksytyną. Wynik oznaczania wrażliwości na meticylinę jest jednocześnie wynikiem dla wszystkich antybiotyków β-laktamowych i nie należy oznaczać wrażliwości na inne leki z tej grupy, a wykonanie takiego oznaczenia może prowadzić do uzyskiwania niewiarygodnych wyników (aktywność in vitro, przy braku skuteczności klinicznej) i poważnych skutków klinicznych oraz epidemiologicznych. Szczepy oporne na meticylinę są klinicznie oporne na wszystkie antybiotyki β-laktamowe dotychczas stosowane w terapii, czyli na: penicyliny, aminopenicyliny, penicyliny izoksazolilowe (oksacylina, kloksacylina, dikloksacylina, flukloksacylina), nafcylinę, cefalosporyny, penicyliny z inhibitorami, cefalosporyny z inhibitorami i karbapenemy

Gronkowce oporne na meticylinę określane są skrótami:

• MRSA w przypadku meticylinoopornych szczepów Staphylococcus aureus;
• MRCNS w przypadku meticylinopornych szczepów gronkowców koagulazo-ujemnych;
• MRSE w przypadku meticylinoopornych Staphylococcus epidermidis.

Mechanizm oporności MLSB u Staphylococcus spp.

Jest to oznaczanie wrażliwości na makrolidy i linkosamidy, które wykonuje się przy użyciu dwóch krążków: erytromycyny i klindamycyny. Jedynie metoda dyfuzyjno-krążkowa pozwala wykryć indukcyjny mechanizm oporności na makrolidy, linkosamidy i streptograminy B. W przypadku oporności na erytromycynę należy zwracać uwagę na spłaszczenie strefy zahamowania wzrostu dookoła krążka z klindamycyną od strony krążka z erytromycyną (kształt litery D) świadczące o indukcyjnym mechanizmie oporności MLSB [24, 25].

Mechanizmy oporności enterokoków

Enterokoki są drobnoustrojami wchodzącymi w skład flory fizjologicznej przewodu pokarmowego. Od końca lat 70. zanotowano wzrost znaczenia tych bakterii jako czynników etiologicznych zakażeń szpitalnych. Najczęściej w materiale klinicznym pobranym od ludzi występuje gatunek Enterococcus faecalis, stwierdzany w 70-80% wszystkich izolatów enterokoków. Enterococcus faecium stanowi 10-15% ogółu enterokoków. Pozostałe gatunki to około 5% ogółu enterokoków występujących w próbkach materiału biologicznego pobieranego od ludzi do badań mikrobiologicznych. Oporność naturalna enterokoków dotyczy: cefalosporyn, niskich stężeń aminoglikozydów, trimetoprimu/sulfametoksazolu, linkozamidów, niskich stężeń glikopeptydów u gatunków: Enterococcus gallinarum, Enterococcus casseliflavus (fenotyp VanC) oraz właściwej dla Enterococcus faecium obniżonej wrażliwości na penicyliny. Do mechanizmów oporności nabytej enterokoków zalicza się: oporność na wysokie stężenia antybiotyków aminoglikozydowych HLAR (ang. high-level aminoglikozyde resistance), oporność na glikopeptydy VRE (ang. vancomycin-resistant Enterococcus) oraz oporność na linezolid LRE (ang. linezolid-resistant Enterococcus). Te mechanizmy mają największe znaczenie kliniczne i epidemiologiczne. Do najważniejszych fenotypów oporności wysokiego stopnia na animoglikozydy zalicza się:

• Fenotyp HLGR (ang. high-level gentamicin resistance), gdzie (MIC >128 μg/mL wg EUCAST) oznacza wysoki poziom oporności na gentamycynę i raportowany jest jako wysoki poziom oporności na wszystkie aminoglikozydy, z wyjątkiem streptomycyny, oraz utratę synergizmu z β-laktamami oraz glikopeptydami.
• Fenotyp HLSR (ang. high-level streptomycin resistance), gdzie MIC >1024 μg/mL wg EUCAST oznacza wysoki poziom oporności na streptomycynę i raportowany jest jako wysoki poziom oporności tylko na streptomycynę, przy zachowanej wrażliwości na pozostałe aminoglikozydy oraz utratę synergizmu z β-laktamami i glikopeptydami dla streptomycyny;
• Termin VRE (ang. vancomycin-resistant enterococci) oznacza oporność na glikopeptydy. Mechanizm oporności na wankomycynę polega na wytwarzaniu przez bakterie zmienionych cząsteczek dipeptydów. Wankomycyna nie jest już w stanie zablokować syntezy peptydoglikanu. Dotychczas opisano 7 fenotypów oporności na wankomycynę. Ze względu na częstość występowania i szybkość rozprzestrzeniania się w populacji bakteryjnej największe znaczenie kliniczne maja fenotypy VanA i VanB.
• Fenotyp VanA to pojawiająca się dopiero w obecności antybiotyku indukowalna oporność wysokiego stopnia na wankomycynę (MIC 64-100 μg/ml) i teikoplaninę (MIC 16-512 μg/ml). Występuje najczęściej u gatunków: E. faecium, E. faecalis, ale również u: E. avium, E. durans oraz E. raffinosum.
• Fenotyp VanB to indukowalna oporność na wankomycynę na różnym poziomie (MIC 4-1024 μg/ml) przy zachowanej wrażliwości in vitro na teikoplaninę (MIC 0,5-1 μg/ml). Występuje u gatunków: E. faecium, E. faecalis oraz E. durans i E. gallinarum.
• Fenotyp VanC to mechanizm oporności naturalnej, związany z konstytutywnym, niskim stopniem oporności na wankomycynę (MIC 2-32 μg/ml) przy wrażliwości na teikoplaninę (MIC 0,5-1 μg/ml). Mechanizm ten występuje u gatunków E. gallinarum oraz E. casseliflavus o niskim potencjale epidemicznym. Jednak wystąpienie u tych gatunków mechanizmu oporności nabytej (VanA, rzadziej VanB) może skutkować ujawnianiem się ciężkich zakażeń szpitalnych [26].

W diagnostyce lekooporności wykorzystywane są także metody molekularne, umożliwiające wykrycie zmian zachodzących zarówno na poziomie DNA, RNA oraz produktu ekspresji genów. Do najważniejszych metod zaliczyć należy: reakcję PCR, PCR-RFLP, RT-PCR, sekwencjonowanie Sangera, Western Blot i mikromacierze.

Metodą opartą na analizie DNA jest reakcja PCR, stosowana najczęściej w przypadku, gdy znany jest mechanizm determinujący lekooporność. Pozostałe metody pozwalające na identyfikację zmian na poziomie DNA to najczęściej modyfikacje standardowej reakcji PCR. Inną techniką stosowaną do oceny lekooporności jest polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych PCR-RFLP (ang. polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism). W technice tej amplifikowany fragment DNA poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym. Jeśli w analizowanym fragmencie zaszła mutacja punktowa, w obrazie elektroforetycznym możliwe będzie wyróżnienie lekoopornych szczepów. Kolejną techniką umożliwiającą identyfikację antybiotykoopornych szczepów jest metoda dideoksy, czyli sekwencjonowanie Sangera, stanowiące (z różnymi modyfikacjami) podstawę odczytywania sekwencji DNA, polegające na kopiowaniu, katalizowanym przez polimerazę DNA, badanej cząsteczki DNA w warunkach in vitro.
Do oceny ekspresji RNA najczęściej stosowanymi technikami są reakcja odwrotnej transkrypcji RT-PCR (ang. reversed-transcriptase PCR) i reakcja PCR w czasie rzeczywistym qPCR (ang. quantitative PCR).

Najważniejsze metody pozwalające na identyfikację lekoopornych szczepów na poziomie produkcji białka to Western Blot i mikromacierze (ang. microarrays). W technice Western Blot (immunoblotting) białka poddane elektroforezie w żelach poliakrylamidowych z dodatkiem siarczanu dodecylu sodu (SDS), nadającego białkom ujemny ładunek, transferowane są na membranę, np. nitrocelulozową. Następnie białka poddaje się inkubacji z przeciwciałem (metoda bezpośrednia). W metodzie pośredniej białka inkubowane są z dwoma rodzajami przeciwciał, swoistym przeciwciałem I rzędu i wyznakowanym przeciwciałem II rzędu. Przeciwciała II-rzędowe mogą być znakowane radioaktywnie, najczęściej jednak są one połączone z enzymem, np. z peroksydazą chrzanową (HRP) lub fosfatazą alkaliczną (AP), co pozwala na przeprowadzenie reakcji barwnej. Mikromacierze w postaci szklanych płytek, membran lub szkiełek, pozwalają na analizę molekularnych sond w postaci 25-60 oligonukleotydowych (ang. oligo array) lub jednoniciowych cDNA (ang. cDNA array). Zasadą mikromacierzy jest hybrydyzacja komplementarnych, wyznakowanych fluorochromami analizowanych sekwencji, odpowiednią sondą molekularną umieszczoną na mikropłytce. Wyróżnia się kilka rodzajów mikropłytek, pozwalających m.in. na identyfikację jednonukleotydowych polimorfizmów w DNA lub ocenę ekspresji genów na poziomie transkrypcji. Mikromacierze pozwalają na ocenę ekspresji jakościowo, półilościowo lub ilościowo tysięcy genów jednocześnie [27-29].

Piśmiennictwo

1. Murray P.R., Rozenthal K.S., Pfaller M.A.: Mikrobiologia. Przondo-Mordarska A. (red.), Urban & Partner, 2011, 9-175.

2. Płusa T.: Zakażenia układu oddechowego – klinika a bakteriologia. „Nowa Medycyna”, 2009, 2, 109- 112.

3. Coupe Z.: Almroth Wright: Founder of Modern Vaccine-The­rapy. Thomas Nelson and Sons Ltd., 1966.

4. Jabłoński A., Zębek S., Mokrzycka A.: Wybrane mechanizmy oporności bakterii na chemioterapeutyki. „Medycyna Wet.”, 2010, 66 (7), 449-452.

5. Janiec W., Krupińska J.: „Farmakodynamika”, 2003, PZWL

6. Nikonorow E., Baraniak A., Gniadkowski M.: Oporność bakterii z rodziny Enterobacteriaceae na antybiotyki β-laktamowe wynikająca z wytwarzania β-laktamaz. „Post. Mikrobiol.”, 2013, 52, 3, 261-271.

7. Jatulewicz I.: Genetyczne podłoże oporności bakterii na antybiotyki glikopeptydowe i β-laktamowe. „Chemistry, Environment, Biotechnology”, 2012, XV, 1-11.

8. Spink W., Ferris V.: Quantitative action of penicillin inhibitor from penicillin-resistant strain of Staphylococcus. „Science”, 1945, 102, 102-221.

9. Markiewicz Z., Kwiatkowski Z.A.: Bakterie, antybiotyki, lekooporność. Wyd. Nauk. PWN, 2010.

10. Luzzaro F. i wsp. : Spread of multidrug-resistant Proteus mirabilis isolates producing An AmpC-type β-lactamase: epidemiology and clinical management. „Int J Antimicrob Agents”, 2008, 33, 328-33.

11. Yang K, Guglielmo B.J.: Diagnosis and treatment of extended­-spectrum and AmpC β-lactamase-producing organisms. „Ann. Pharmacother”, 2007, 41, 1427-1435.

12. Hryniewicz W., Żabicka D., Bartoszewicz M.: Rekomendacje Zespołu Roboczego ds. wprowadzania zaleceń Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania lekowrażliwości EUCAST. 2011, 1-8.

13. Semczuk K. i wsp.: Antimicrobial resistance of Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae isolated from children with community acquired respiratory tract infections in Central Poland. „J Antimicrob Agents”, 2004, 23, 39-43.

14. Kadłubowski M., Skoczyńska M., Klarowicz A., Hryniewicz W.: Antimicrobial susceptibility of the bacteria causing community-acquired respiratory tract infections in Poland, 2005-2006 (continuation of the Alexander Project). 18^th ECCMID, Barcelona 2008, 674.

15. Skoczyńska A., Kadłubowski M., Waśko I., Fiett J., Hryniewicz W.: Resistance patterns of selected respiratory tract pathogens in Poland. „Clin Microbiol Infect.”, 2007, 13, 338-83.

16. Souli M., Kontopidou F.V., Papadomichelakis E.: Clinical experience of serious infections caused by Enterobacteriaceae producing VIM-1 metallo-β-lactamase in a Greek University Hospital. „Clin. Infect. Dis.”, 2008, 15, 847-854.

17. Vatopoulos A.: High rates of metallo-β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae in Greece – a review of the current evidence. „Euro Surveill”, 2008, 3, 8023.

18. Nordmann P, Cuzon G, Naas T.: The real threat of Klebsiella pneumoniaecarbapenemase-producing bacteria. „The Lancet Infectious Diseases”, 2009, 9: 228-236.

19. Cantón R. i wsp.: European Network on Carbapenemases. Rapid evolution and spread of carbapenemases among Enterobacteriaceae in Europe. „Journal of Clinical Microbiology”, 2012, 5, 413-431.

20. Cai J.C., Zhou H.W., Zhang R., Chen G.X.: Emergence of Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, and Escherichia coli Isolates possessing the plasmid-mediated carbapenem-hydrolyzing β-lactamase KPC-2 in intensive care units of a Chinese hospital. „Antimicrob. Agents Chemother”, 2008, 52, 2014-2018.

21. Nalewajek T., Kłósek M., Ziora D.: Rola patogenów alarmowych w chorobach bakteryjnych u pacjentów hospitalizowanych w Katedrze i Klinice Chorób Płuc i Gruźlicy Samodzielnego Publicznego Szpitala Klinicznego nr 3 w Zabrzu w latach 2008-2012. „Przegląd Epidemiologiczny”, 2018, 72 (3), 325-336.

22. Report from the Commission to the council on the basis of member states reports on the implementation of the council recommendation (2002/77/EC) on the prudent use of Antimicrobial Agents in human medicine, 2006, 1-1.

23. https://www.polmicro.edu.pl/polmicro/docs/paleczki_enterobacteriaceae_1.pdf.

24. http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_9.0 Breakpoint_Tables.pdf.

25. http://korld.edu.pl/pdf/Stanowiska_Zespolu_Roboczego_2018_strona.pdf.

26. Kuch A., Żabicka D., Hryniewicz W.: Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki 2009. Oznaczanie wrażliwości Enterococcus spp. 2009, 1-12.

27. Żebrowska M., Sałagacka A., Mirowski M., Balcerczak E.: Techniki molekularne wykorzystywane w diagnostyce lekooporności związanej z transporterami nadrodziny ABC. „Journal of Laboratory Diagnostics”, 2011, 47, 2, 205-209.

28. Opiela J.: Analiza ekspresji genów na poziomie białek przy użyciu techniki western-blot. „Wiadomości Zootechniczne”, 2006, XLIV, 11-13.

29. Jałowiecki Ł., Chojniak J., Płaza G.: Analiza antybiotykoodporności w szczepach środowiskowych, Interdyscyplinarne zagadnienia w inżynierii i ochronie środowiska bakteryjnych. [W:] Kutyłowska M. (red.): Interdyscyplinarne zagadnienia w inżynierii i ochronie środowiska. 2016, 7, 1-9.

fot. archiwum autorów

Fot. 1a, b. Antybiogram metodą dyfuzyjno-krążkową Staphylococcus aureus

Fot. 2a, b. E-test gentamycyny i cefotaksymu pałeczek Gram-ujemnych z rodziny Enterobacterales

Fot. 3a, b. ESBL⁺ (strona lewa) i ESBL- (strona prawa) szczepu E. coli

Fot. 4a, b. KPC⁺ (strona lewa) i KPC- (strona prawa) szczepu Klebsiella pneumoniae

Fot. 5a, b. MBL^- metodą dyfuzyjno-krążkową (strona lewa) i metodą gradientowo-dyfuzyjną (strona prawa) szczepu Enterobacter cloacae

Fot. 6a, b. OXA-48⁺ (strona lewa); OXA-48^- (strona prawa)

Fot. 7. Szczep Staphylococcus epidermidis oporny na metycylinę

Fot. 8. Mechanizm MLSB szczepu Staphylococcus epidermidis

Fot. 9. Szczep Enterococcus faecalis HLAR