Przegląd testów komercyjnych stosowanych w pierwszym etapie w celu wykrycia zakażenia Borrelia burgdorferi
W całej Polsce odnotowuje się znaczny wzrost zachorowań na boreliozę. Diagnostyka laboratoryjna oparta jest na wykrywaniu przeciwciał klasy IgM i IgG. Stosowanie w laboratoriach testów w oparciu wyłącznie o charakterystykę podaną przez producenta może być źródłem wyników fałszywie ujemnych.
Czynnikiem etiologicznym boreliozy z Lyme są krętki Borrelia burgdorferi sensu lato. Siedem genogatunków Borrelia uznawanych jest za odpowiedzialne za rozwój boreliozy z Lyme. Należą do nich: B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii, B. bissettii oraz B. spielmanii [1], a także B. lusianiae i B. valaisiana [2]. Wszystkie wymienione mogą wywoływać boreliozę w Europie, najczęściej jednak dotyczy to trzech gatunków: B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii oraz B. garinii [3]. Poszczególne szczepy wiąże się z rozwojem różnych obrazów choroby: Borrelia afzelii powoduje zazwyczaj rozwój przewlekłego zanikowego zapalenia skóry, Borrelia burgdorferi sensu stricto jest najczęściej odpowiedzialna za rozwój zapalenia stawów, natomiast neuroboreliozę może powodować zarówno B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, jak i B. garinii [3].
Tab. 2. Stopień zakażenia kleszczy krętkami B. burgdorferi s.l. w poszczególnych regionach Polski [5, 9-17]
Drogi zakażenia
Zakovska i wsp. (2008) wymieniają kleszcze z rodziny Ixodidae jako najczęstszy wektor zakażenia krętkami Borrelia. Najbardziej popularnym w Europie jest Ixodes ricinus natomiast w Ameryce Północnej – Ixodes scapularis oraz w Azji – Ixodes persulcatus [4]. Wykazano również obecność tych bakterii w organizmach komarów Culex i Aedes i innych owadów krwiopijnych, co wpływa na utrzymywanie się krętków w zoonotycznym rezerwuarze zwierząt, a przypadkowo może prowadzić do infekcji człowieka [5-7].
Cykl rozwojowy kleszczy Ixodes ricinus trwa 2-3 lata i przebiega od jaja, poprzez stadia larwy i nimfy, do stadium dojrzałego. Aby osiągać kolejne stadia, aż do postaci dorosłej, kleszcze muszą wyssać krew kręgowca na każdym etapie rozwoju [2]. Do zakażenia krętkami Borrelia burgdorferi dochodzi, gdy żywicielem kleszczy stanie się kręgowiec już zarażony tymi bakteriami. Takie zakażenie jest przekazywane transstadialnie i transowarialnie. Następnie kleszcze przekazują zakażenie kolejnemu żywicielowi za sprawą przemieszczania się krętków z hemolimfą z przewodu pokarmowego do ślinianek. Żywicielami kleszczy są gady, ptaki i ssaki. Krętki Borrelia burgdorferi mogą bytować cyklicznie na takich gatunkach zwierząt, jak: gryzonie, jaszczurki, ptaki, ssaki (np. jeleniowate). Każdy żywiciel kleszczy może być rezerwuarem krętków Borrelia burgdorferi.
Epidemiologia
Lindgren i Jaenson (2006) zwracają uwagę na fakt, że kleszcze w trakcie żerowania na żywicielu pozostają na jego ciele przez kilka dni, co sprawia, że przemieszczają się wraz z nim do nowych lokalizacji. Małe ssaki i gryzonie żyją raczej na ograniczonym terytorium, duże ssaki, takie jak jelenie, przemieszczają się w obrębie od 50 do 100 hektarów [8]. Natomiast ptaki wędrowne, które przemieszczają się na bardzo duże odległości po swoich ścieżkach migracyjnych, odgrywają niezwykle ważną rolę w tworzeniu nowych lokalizacji dla kleszczy, a co za tym idzie, dla patogenów przez nich przenoszonych [8]. Tab. 1 przedstawia rozpowszechnienie i dominujący rezerwuar krętków Borrelia burgdorferi.
Hubalek i Halouzka (1997) podają, że najbardziej rozpowszechnionymi genogatunkami w całej Europie są Borrelia afzelii i garinii. Rzadziej występuje Borrelia burgdorferi sensu stricto, najczęściej we wschodniej Europie (Polska, Słowacja). Bardzo rzadko występują genogatunki B. valaisiana i B. lusitaniae [3].
W Polsce stopień zakażenia kleszczy I. ricinus przez B. burgdorferi s.l. jest zróżnicowany. W tab. 2. przedstawiono dane dotyczące poszczególnych regionów Polski.
Na podstawie danych udostępnionych na stronie internetowej PZH [18] możliwe jest zobrazowanie zachorowalności w Polsce na przestrzeni kilkunastu ostatnich lat. Na rys. 1. zobrazowano liczbę zachorowań na boreliozę w Polsce i w województwie śląskim w latach 1998-2016. Widoczny na wykresie jest bardzo wysoki wzrost liczby zachorowań, który może być związany zarówno z częstszą zapadalnością na tę chorobę, jak również z pojawianiem się coraz bardziej dokładnych testów diagnostycznych umożliwiających rozpoznanie tej infekcji.
Rys. 2. przedstawia zapadalność na boreliozę na 100 tys. mieszkańców Polski oraz województwa śląskiego [18]. W 2016 r. najwyższą zapadalność odnotowano dla województwa podlaskiego i wynosiła ona 134,9. Drugie pod tym względem było województwo warmińsko-mazurskie – 97,2, trzecie natomiast województwo lubelskie – 89,2. Najniższą zapadalność na 100 tys. mieszkańców odnotowano w województwie wielkopolskim (wynosi 16,6). W 2016 r. średnia zapadalność na 100 tys. mieszkańców dla Polski wyniosła 55,2. Jest to wzrost o ponad połowę w porównaniu do roku poprzedniego. Na wykresie widoczne jest, że zapadalność na 100 tys. mieszkańców dla województwa śląskiego od 2005 r. jest wyższa od średniej zapadalności dla Polski, a różnica ta w ostatnich latach jest coraz większa. W 2016 r. zapadalność na 100 tys. mieszkańców dla śląska wyniosła 71,5.
Rys. 3. przedstawia zachorowalność na boreliozę w poszczególnych województwach Polski w 2016 r. W województwie śląskim liczba zachorowań w porównaniu do innych województw była najwyższa i wynosiła 3264 osoby. Drugie pod tym względem było województwo małopolskie – 2946 osób, trzecie – mazowieckie (2184 osoby). Najmniejszą liczbę zachorowań odnotowano w województwie świętokrzyskim – 398 osób. W 2016 r. w całej Polsce odnotowano 21 200 zachorowań na boreliozę [18].
Diagnostyka boleriozy
Diagnostyka boreliozy staje się problematyczna, w sytuacji gdy objawy kliniczne nie są typowe (np. brak rumienia wędrującego, brak ugryzienia przez kleszcza w wywiadzie), wtedy bardzo istotną częścią rozpoznania są wyniki badań laboratoryjnych. Z tego powodu wskazane jest używanie takich metod diagnostycznych, które w jak najmniejszym stopniu będą obarczone wynikami fałszywie dodatnimi oraz ujemnymi. Najbardziej swoistym badaniem jest bezpośrednie wykrycie patogenu w materiale badanym, czyli badanie mikrobiologiczne [19]. Niestety w przypadku zakażenia Borrelią metoda ta charakteryzuje się zbyt niską czułością (50-70% – bioptaty skóry; 10-30% – PMR; ok. 1% - płyn stawowy). Metoda PCR, która wykrywa materiał genetyczny bakterii, jest skuteczniejsza jedynie w przypadku płynu stawowego (50-70%) [20]. Dlatego też z wyboru stosowane są metody serologiczne, wykrywające w badanym organizmie przeciwciała wytwarzane w odpowiedzi na kontakt z patogenem. Jest to jednak pośrednia diagnostyka, co powoduje, że wykrycie przeciwciał nie jest równoznaczne z obecnością patogenu w danym momencie. Wskazuje jedynie na kontakt z bakterią w przeszłości. Problematyczne jest również to, że metody badań stosowane w diagnostyce serologicznej boreliozy często nie posiadają standaryzacji [19]. Niejednoznaczny obraz kliniczny boreliozy oraz zróżnicowana odpowiedź immunologiczna na występujące w środowisku gatunki Borrelia burgdorferi stwarzają trudności w rozpoznaniu zakażenia. Diagnostyka laboratoryjna oparta jest na wykrywaniu przeciwciał klasy IgM i IgG. Antygeny do wykrywania przeciwciał pozyskiwane są z ekstraktów z hodowli trzech genogatunków Borrelii, tj.: B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii i B. garinii lub też metodą rekombinacji. W wielu przypadkach występują reakcje krzyżowe z antygenami innych rodzajów bakterii, co wymaga przeprowadzenia kolejnych badań z wykorzystaniem metody western blot (immunoblottingu). W ofercie różnych firm są zestawy wykrywające przeciwciała przeciw różnym antygenom Borrelii, które pozwalają z dużą dokładnością potwierdzić obecność swoistych przeciwciał przeciw antygenom Borrelii. W tab. 3 przedstawione zostały dane dotyczące charakterystyki najczęściej używanych testów ELISA, udostępniane przez producentów w instrukcjach do testów czy też w formie skróconej charakterystyki danego testu. Forma tabeli pozwala w prosty sposób porównać testy oferowane komercyjnie, chociażby pod względem składu antygenowego danego testu czy też pochodzenia tych antygenów. Interesujący jest również fakt braku systematyki w przekazywaniu informacji co do czułości i swoistości wielu testów. Niektórzy producenci podają ją jedynie w procentach, bez podawania szczegółów, takich jak test użyty do porównania, wielkość próby badanej.
W niektórych przypadkach nie ma w ogóle informacji wprost o czułości i/lub swoistości danego testu. Czułość często podawana jest w dość zawoalowany sposób, tzn. w formie tabeli przedstawiającej wyniki badania próbek pacjentów z rozpoznaną boreliozą w różnych stadiach choroby. Tab. 4 prezentuje dane dotyczące czułości najczęściej używanych testów ELISA; badanie przeprowadzono na grupie pacjentów z rozpoznaną boreliozą w różnych stadiach. Z przedstawionej tabeli wynika, że we wczesnym stadium choroby najwyższą czułość osiąga test recomWell Borrelia IgM (Mikrogen) – 86% oraz skojarzenie dwóch testów dla obu klas przeciwciał Anti-Borrelia ELISA IgM i Anti-Borrelia plus VlsE ELISA IgG (Euroimmun) 91%. W późniejszych stadiach najwyższą czułość osiągają testy: recomWell Borrelia IgG (Mikrogen) oraz skojarzenie dwóch testów Anti-Borrelia rec. IgM
Tab. 3. Dane dotyczące charakterystyki najczęściej używanych testów ELISA; udostępniane przez producentów [21-34]
* Producent podaje wyłącznie czułość dla poszczególnych stadiów choroby, wyznaczoną w badaniu pacjentów z rozpoznaną boreliozą w różnych jej stadiach. Dane te zostały przedstawione w osobnej tabeli (tab. 4).
** Do wyznaczenia czułości i swoistości przeprowadzono 2 odrębne doświadczenia na 2 różnych próbach badanych. Wartość pierwsza dotyczy czułości – pacjenci z rozpoznaną boreliozą w różnych stadiach; druga swoistości – osoby zdrowe.
Tab. 4. Dane dotyczące czułości najczęściej używanych testów ELISA; badanie przeprowadzono na grupie pacjentów z rozpoznaną boreliozą w różnych stadiach. W przypadku testów VIDAS dane dotyczą poszczególnych stadiów choroby, a nie rozpoznanych objawów [21-34]
Podsumowanie
Podsumowując, bardzo istotny jest fakt walidacji danej metody w laboratorium medycznym. Informacje zawarte w materiałach dostarczanych przez producentów często mają charakter marketingowy. Stosowanie w laboratoriach testów w oparciu wyłącznie o charakterystykę podaną przez producenta może być źródłem wyników fałszywie ujemnych. Jest to szczególnie istotne u pacjentów, u których w wywiadzie brak jest typowych objawów klinicznych choroby.
