Wiedza na temat właściwości biochemicznych mikroorganizmów stanowi fundament we wstępnej diagnostyce bakteriologicznej oraz grzybiczej. Nierzadko stanowi ona źródło i podstawy doboru odpowiednich środków zapobiegających chociażby rozwojowi infekcji. Efekt ten można uzyskać poprzez połączenie posiadanej wiedzy na temat drobnoustrojów z doborem odpowiedniej metody hodowlanej. W tym celu stosowane są podłoża mikrobiologiczne, używane przy wielu okazjach, ale przede wszystkim pożądane w wizualnej – fenotypowej – ocenie mikroorganizmów w badanym materiale. Według definicji zawartej w normie ISO PN-EN 1659:2004: „Pożywka mikrobiologiczna to zestaw substancji w płynnej, półpłynnej lub stałej postaci, zawierający naturalne i/lub syntetyczne składniki służące do namnożenia lub utrzymania przy życiu drobnoustrojów” [8].
Zachowanie optymalnych warunków wzrostowych dla poszukiwanych drobnoustrojów jest podstawową zasadą w analizie mikrobiologicznej. Pożywka mikrobiologiczna powinna w jak największym stopniu odzwierciedlać naturalne warunki sprzyjające wzrostowi bakterii, grzybów bądź konkretnej ich grupy. Na jakość stosowanych podłóż i pożywek wpływa wiele czynników, od których zależeć będzie możliwość i jakość rozwoju oraz wzrostu drobnoustrojów. Do tych czynników należą przede wszystkim składniki odżywcze, stanowiące źródło węgla, azotu, soli mineralnych, wody oraz witamin. Poza substancjami wzrostowymi ważnymi elementami są odczyn pH oraz często substancje hamujące bądź promujące wzrost jednej grupy nad innymi.

Historia podłóż mikrobiologicznych

Początki hodowli mikroorganizmów sięgają XIX w., kiedy to francuski chemik i mikrobiolog Ludwik Pasteur zastosował w tym celu bulion odżywczy na bazie wyciągu mięsnego. W 1860 r. podczas prac nad medium sprzyjającym fermentacji sporządził on recepturę złożoną z drożdży, popiołu, cukru i soli amonowych. Od jego obserwacji dotyczących wpływu substancji odżywczych w pożywce na rozwój bakterii rozpoczęły się prace nad udoskonalaniem receptury idealnej pożywki bakteriologicznej [4].
Konkretny wkład w prace nad ulepszaniem warunków hodowlanych dla bakterii miały odkrycia Roberta Kocha, ogłoszonego ojcem pożywek hodowlanych. Jednym z jego licznych wkładów w rozwój mikrobiologii było określenie receptury zapewniającej optymalny wzrost mikroorganizmów. Jednakże pomimo tego, że wyciąg mięsny jest bogatym źródłem składników odżywczych, do idealnej pożywki brakowało dodatku źródła azotu i aminokwasów. W 1884 r. Fredrick Loeffler dodał do receptury Kocha pepton oraz sole mineralne, które oprócz dostarczenia niezbędnego do rozwoju azotu wpłynęły pozytywnie na osmotyczność całej pożywki [1, 4]. Nie ma jednak wątpliwości, że najważniejszym wkładem Kocha w udoskonalanie metod hodowlanych bakterii było zastosowanie substancji żelujących powodujących zestalanie pożywek mikrobiologicznych. Potrzeba ta wyniknęła z prostego wniosku – braku możliwości izolowania pojedynczych kultur bakteryjnych z pożywek płynnych. Pierwszą podjętą w tym kierunku próbą było użycie żelatyny. Pomimo zdolności żelujących, substancja ta ma dwie główne wady. Pierwszą z nich jest zmiana stanu skupienia na ciekły w temperaturze powyżej 25oC, a drugą fakt, że niektóre drobnoustroje posiadają zdolność produkcji enzymu żelatynazy, powodującej hydrolizę żelatyny [4].
W 1882 r. dzięki pomysłowi żony asystenta Roberta Kocha, pani Hesse, żelatynę zastąpiono agarem, czyli związkiem pozyskiwanym z krasnorostów, zbudowanym głównie z galaktozy. Jego właściwości chemiczne i fizyczne umożliwiły zastosowanie agaru w mikrobiologii. W ten sposób w nieodległej przyszłości, dzięki możliwości zaobserwowania kultur bakterii na powierzchni zestalonego agaru, powstał termin „kolonia bakteryjna”. Pięć lat później swój wkład w rozwój bakteriologii miał Julius R. Petri, poprzez zaprojektowanie nowego naczynia przeznaczonego do hodowli bakterii na pożywkach stałych, znanego dzisiaj jako szalka Petriego. Udoskonalenie polegało na pozbyciu się dotychczasowych płaskich talerzy i zastąpieniu ich okrągłymi, szklanymi szalkami z pokrywkami uniemożliwiającymi kontaminację podłoży drobnoustrojami znajdującymi się w otoczeniu. Szalki Petriego używane były w wersji wykonanej ze szkła aż do połowy lat 60. XX w., kiedy to wyprodukowano pierwsze partie tych naczyń w wersji plastikowej [4].
W ten sposób rozpoczęły się prace nad określeniem idealnej pożywki utrzymującej rozwój mikroorganizmów wraz z możliwością ich obserwacji w postaci pojedynczych kolonii na powierzchni agaru, co spowodowało gwałtowny rozwój mikrobiologii, szczególnie klasyfikacji i identyfikacji bakterii, a dalsze prace nad uniwersalną i idealną pożywką w efekcie przyczyniły się do doskonalenia diagnostyki [1, 4].

Podział pożywek mikrobiologicznych

Istnieje kilka możliwości kategoryzacji podłóż mikrobiologicznych – ze względu na ich skład chemiczny, konsystencję, zawartość lub zastosowanie (rys. 1). Główną różnicą pomiędzy podłożami naturalnymi a syntetycznymi jest ich skład. Podłoża naturalne opierają się na bazie składników pochodzenia naturalnego, czyli wyciągach z tkanek, warzyw i hydrolizatach białek, dlatego trudno jest określić dokładny skład danej pożywki. Natomiast podłoża syntetyczne posiadają precyzyjnie określony skład chemiczny [1, 3].
Konsystencja danego podłoża uzależniona jest od ilości wykorzystywanego agaru. Jest to substancja żelująca, której głównym składnikiem jest galaktoza. Agar pozyskiwany jest z krasnorostów, a jego zastosowanie, oprócz wykorzystywania w celach laboratoryjnych, powszechne jest w przemyśle spożywczym, farmacji i kosmetologii. Do podłóż płynnych zaliczamy pożywki niezawierające w swoim składzie agaru, np. bulion lizogenny LB, służący do hodowli bakteryjnej. Podłoża półpłynne zawierające od 0,1% do 0,7% agaru w swoim składzie wykorzystywane są przede wszystkim do hodowli mikroorganizmów mikroaerofilnych, jako podłoża transportowe. Podłoża stałe, do których należy większość znanych podłóż mikrobiologicznych, np. podłoże TSA lub agar odżywczy, zawierają 1,5-2% agaru. Jest to jedyne, spośród tych trzech rodzajów, podłoże umożliwiające izolację i obserwację pojedynczych kolonii zarówno na powierzchni, jak i wewnątrz warstwy agarowej [1-3, 7].
Wśród podłóż mikrobiologicznych podzielonych ze względu na zawartość składników odżywczych można wyróżnić podłoża: minimalne, pełne oraz wzbogacone. Pożywki minimalne zawierają jedynie niezbędne składniki odżywcze, które pozwolą na wzrost i utrzymanie żywotności bakterii. Podłoże pełne różni się od minimalnego tym, że pozwala ono na zapewnienie większej ilości składników odżywczych, a w efekcie lepszy wzrostu mikroorganizmów. Podłoża wzbogacone zawierają w swoim składzie substancje dodatkowe, np. krew, mleko lub surowicę, i wykorzystywane są do wykrywania drobnoustrojów wymagających bądź trudnych w hodowli. Do powszechnie używanych podłóż wzbogaconych należą: agar z krwią, używany do obserwacji zdolności hemolitycznych bakterii, czy agar czekoladowy, zawierający zlizowaną krew i służący między innymi do izolacji bakterii z rodzaju Haemophilus [3,  9].
Najbardziej obszernym i definiującym podziałem podłóż jest podział ze względu na ich funkcje. Wyróżnia się tutaj podłoża: namnażające, których funkcją jest dostarczanie mikroorganizmom składników odżywczych i optymalnych warunków w celu podtrzymania przyrostu biomasy; selektywne – posiadające substancje umożliwiające wzrost konkretnego rodzaju lub gatunku drobnoustrojów oraz substancje hamujące wzrost innych organizmów; różnicujące – zawierające tzw. indykatory chemiczne, dzięki którym można określić dane grupy bakterii; wybiórczo-różnicujące – pożywki, które łączą w sobie cechy podłóż wybiórczych i różnicujących; transportowe – pozwalające na utrzymanie żywotności drobnoustrojów podczas ich transportu do laboratorium; transportowo-wzrostowe, które dodatkowo pozwalają na namnażanie się drobnoustrojów podczas ich transportu i przechowywania; i ostatni rodzaj, czyli podłoża służące do oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów [3, 9] (tab. 1).

Diagnostyka biochemiczna

W mikroorganizmach, tak jak we wszystkich organizmach żywych, zachodzą podstawowe procesy życiowe, takie jak oddychanie oraz odżywianie. Produkty powstałe w wyniku tych procesów są nierzadko wykorzystywane we wstępnej diagnostyce. Najprostszym przykładem jest fermentacja cukrów przez bakterie. Na podstawie wiedzy na temat tego, jaki rodzaj lub gatunek bakterii wykorzystuje dany cukier (glukozę, fruktozę, laktozę), można dobrać odpowiedni zestaw podłóż, który potwierdzi lub wykluczy poszukiwany mikroorganizm. Wykazywanie, że badany drobnoustrój przeprowadza procesy beztlenowe lub tlenowe, jest kluczowym czynnikiem różnicujących w doborze metody hodowlanej oraz inkubacji.
Na przykładzie rutynowego badania mikrobiologiczne w kierunku Staphylococcus aureus w materiale klinicznym, można stwierdzić, że kluczowy jest dobór odpowiednich podłóż, które umożliwią identyfikację pożądanego gatunku bez konieczności prowadzenia dalszych badań. Gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus) jest Gram-dodatnim ziarniakiem, którego komórki w obrazie mikroskopowym często tworzą skupiska przypominające grona. Gronkowce preferują środowisko bogate w tlen, a na standardowej pożywce agarowej tworzą drobne, najczęściej żółte kolonie. Charakterystyczną cechą gronkowców jest ich zdolność do zasiedlania środowisk silnie zasolonych, zawierających do 15% chlorku sodu. Ponadto możliwa jest obserwacja hemolizy typu β na podłożu zawierającym krwinki baranie. Będąc w posiadaniu takiej wiedzy diagnostycznej, można przystąpić do posiewu materiału z wykorzystaniem wyłącznie dwóch podłóż mikrobiologicznych: MSA (ang. Mannitol Salt Agar), zwanym również podłożem Chapmana, oraz agaru z krwią (ang. Blood Agar) [8].
Podłoże MSA zawiera peptony i wyciąg wołowy, stanowiące źródło odżywcze, chlorek sodu w stężeniu 7,5%, powodujący zahamowanie wzrostu innych drobnoustrojów niebędących gronkowcami, oraz czerwień fenolową, stanowiącą indykator reakcji fermentacji mannitolu obecnego w pożywce. S. aureus, jako przedstawiciel gronkowców koagulazododatnich, spowoduje, poprzez fermentację mannitolu, zmianę zabarwienia podłoża z czerwonego/różowego na żółty. Z kolei gatunki koagulazoujemne wyrosłyby w postaci bezbarwnych lub lekko różowych kolonii na niezmienionym różowoczerwonym podłożu. Wykorzystanie podłoża zawierającego krwinki umożliwi obserwację produkcji hemolizyny, czyli enzymu powodującego hydrolizę komórek krwi. Gronkowiec złocisty wywołuje hemolizę typu β, czyli doprowadza do całkowitego rozkładu krwinek. Charakteryzuje się to utworzeniem otoczki wokół kolonii z widocznym miejscem prześwitu w podłożu.
W nowoczesnej diagnostyce oprócz podłóż mikrobiologicznych stosuje się testy potwierdzające, które mają za zadanie jak najbardziej uwiarygodnić uzyskany wynik. Niemniej jednak, wykorzystując te dwa podstawowe podłoża, można z niemal całkowitą pewnością potwierdzić bądź wykluczyć obecność Staphylococcus aureus w badanym materiale [5, 7].

Kontrola jakości podłóż mikrobiologicznych 

Ze względu na postać pożywki można podzielić na: gotowe do użycia, suche i niekompletne. Bez względu na to, wszystkie wyżej wymienione rodzaje powinny posiadać odpowiednią, wymaganą jakość. Laboratorium zarówno w przypadku, kiedy produkuje własne pożywki, jak i kupuje bądź przygotowuje gotowe, jest zobowiązane do samodzielnego kontrolowania ich jakości poprzez sprawdzanie ich właściwości [9].
Kontrola stosowanych pożywek jest kluczowym elementem dopuszczenia ich i późniejszego wykorzystania do diagnostyki i analiz mikrobiologicznych. W przypadku laboratorium samodzielnie produkującego podłoża wymagana jest pełna kontrola jakości, uwzględniająca określenie właściwości fizykochemicznych oraz mikrobiologicznych (żyzność, jałowość, selektywność i specyficzność). Pożywki komercyjne, kupowane jako gotowe do użycia bądź w części przygotowane przez producenta, posiadają certyfikaty jakości zapewniające o ich skuteczności. Niemniej jednak laboratorium powinno samo określić reguły kontroli jakości zakupionych pożywek, uwzględniając przy tym dokumentację potwierdzającą jakość pożywek (certyfikat jakości) oraz ocenę wizualną opakowania, w którym podłoża zostały przetransportowane i dostarczone [3, 9].
Kontrola właściwości fizykochemicznych komercyjnych pożywek mikrobiologicznych opiera się w dużej mierze na ich ocenie wizualnej. W przypadku szalek Petriego z podłożami agarowymi należy wziąć pod uwagę chociażby grubość warstwy, homogenność, stabilność żelu oraz ogólny wygląd zewnętrzny, opierający się na zgodności zabarwienia bądź klarowności gotowego produktu. Z kolei potwierdzenia użyteczności pożywek pod względem mikrobiologicznym można dokonać, wykorzystując w tym celu szczepy kontrolne, referencyjne. Kontrola mikrobiologiczna pożywek w pierwszym etapie ma na celu zapewnienie użytkownika o jałowości wykonanego bądź otrzymanego produktu. Najprostszym sposobem, aby przekonać się o sterylności podłoża, jest jego inkubacja w postaci gotowej szalki Petriego lub probówki w inkubatorze o temperaturze odpowiedniej dla danego typu podłoża oraz obserwacja ewentualnych zanieczyszczeń, najczęściej widocznych po 24 godzinach.
Kolejnymi aspektami ważnymi podczas kontroli mikrobiologicznej są: żyzność, czyli wpływ składników odżywczych na wzrost drobnoustrojów, oraz selektywność, czyli promowanie wzrostu konkretnej grupy mikroorganizmów nad innymi. Ponadto, wykorzystując szczepy kontrolne, jesteśmy w stanie określić specyficzność danego podłoża [9].

Podsumowanie

Pomimo rosnącego trendu automatyzacji laboratoriów badawczych wykorzystujących w swojej pracy detekcję mikroorganizmów, użycie podłóż mikrobiologicznych stanowi niepodważalny element pracy każdego diagnosty laboratoryjnego. Są to względnie szybkie, łatwe testy, które przedstawiają wiarygodne wyniki. Wykorzystanie przez mikroorganizmy odpowiednich substratów owocuje otrzymaniem konkretnych produktów, które świadczą o pozytywnym lub negatywnym przeprowadzeniu reakcji, a efektem tego jest wynik badania. Szczególnie pomocne okazują się podłoża selektywne oraz wybiórczo-różnicujące, bo to one ukierunkowują badanie, ograniczając wzrost mikroflory towarzyszącej. Wykorzystanie pożywek jest podstawowym i kluczowym etapem w namnażaniu, wykrywaniu i identyfikacji mikroorganizmów.

Piśmiennictwo
1.    Bulanda M., Zawilińska B. i wsp.: Bakteriologia szczegółowa. [W:] Mikrobiologia lekarska. Red. P.B. Heczko, M. Wróblewska, A. Pietrzyk, Warszawa 2014, 100-236.
2.    De la Maza L.M., Pezzlo M.T., Shigei J.T. et al.: Color Atlas of Medical Bacteriology. 2nd Edition, ASM Press, USA, 2013.
3.    Mikołajczyk A., Stefaniuk E., Bosacka K., Hryniewicz W.: Właściwości i zastosowanie podłóż mikrobiologicznych. „Postępy Mikrobiologii”, 2016, 3, 320-329.
4.    Sandle T.: History and development of microbiological culture media. „The Journal Institute of Science and Technology”, 2011, 10-14.
5.    Stefaniuk E.: Standaryzacja testów lekowrażliwości i kontrola jakości. „Aktualności BioMerieux”, 2006, 39, 12-16.
6.    Szewczyk E.M., Dudkiewicz B., Kwaszewska A. i in.: Podłoża, próby i metody diagnostyczne. Schematy diagnostyczne. [W:] Diagnostyka mikrobiologiczna. Red. E.M. Szewczyk, Warszawa 2013, 404-459.
7.    Zeidler A.: Ocena odpowiedzi cytokinowej u osób z przewlekłymi zakażeniami Staphylococcus aureus. Rozprawa doktorska, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej UM w Poznaniu, 2012.
8.    PN-EN ISO 1659:2004 Systemy diagnostyczne in vitro – Pożywki mikrobiologiczne – Terminy i definicje.
9.    Wendt U., Strzyż M.: Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym. „Diagnostyka Laboratoryjna”, 2012, 48, 2, 187-197.