fot. Istock

TITLE: Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria – characteristics and diagnosis

STRESZCZENIE: Napadowa nocna hemoglobinuria (NNH) jest klasyfikowana do grupy rzadkich, nabytych, nieimmunologicznych niedokrwistości hemolitycznych. W patogenezie NNH główną rolę odgrywają aktywowane na powierzchni komórek krwi składowe dopełniacza, które indukują lizę erytrocytów. Do ciężkich powikłań NNH zalicza się m.in.: anemię, zakrzepicę, uszkodzenia nerek i dystonię mięśni gładkich. Choroba występuje zazwyczaj u młodych dorosłych i wymaga specjalistycznej diagnostyki. Głównym narzędziem pozwalającym na rozpoznanie i monitorowanie NNH jest cytometria przepływowa. Mimo opracowania nowych schematów terapeutycznych, rokowanie w NNH jest niekorzystne.

SŁOWA KLUCZOWE: nocna napadowa hemoglobinuria, dopełniacz, cytometria przepływowa

SUMMARY: Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH) is classified as a rare, acquired, non-immune haemolytic anaemia. In the pathogenesis of PNH, activated complement components induce the lysis of blood cells. PNH complications include anaemia, thrombosis, kidney dysfunction and smooth muscle dystonia. The disease occurs in young adults and requires specialised diagnostics. Flow cytometry is the main tool for recognizing and monitoring PNH. Despite the new therapeutic regimens, the prognosis for PNH is unfavourable.

KEYWORDS: paroxysmal nocturnal haemoglobinuria, complement, flow cytometry

Układ dopełniacza jest uznawany za jeden z najstarszych mechanizmów nieswoistej odporności przeciwzakaźnej. Jest jednym z „ogniw” łączących odporność nieswoistą ze swoistą, ukierunkowaną odpowiedzią immunologiczną. W skład układu dopełniacza wchodzi ponad 30 nieaktywnych białek produkowanych przez komórki wątroby i niektóre komórki krwi. Aktywacja układu dopełniacza może zachodzić na drodze: klasycznej, alternatywnej i lektynowej [1].

Klasyczna i lektynowa ścieżka aktywacji dopełniacza jest inicjowana przez czynniki zakaźne, podczas gdy szlak alternatywny ciągle wykazuje niską aktywność. Organizm wykształcił kilka mechanizmów kontrolujących aktywację kaskady dopełniacza. Czynniki dezaktywujące dopełniacz skracają okres połowicznego rozpadu konwertaz C3 i C5 (enzymów aktywujących białka dopełniacza) lub wyłapują aktywne składowe dopełniacza, uniemożliwiając ich połączenie z błoną komórkową [2].

Na powierzchni komórek znajduje się kilka czynników i receptorów uniemożliwiających zaktywowanie kaskady dopełniacza. Jednymi z białek, które pełnią funkcję inhibitorów dopełniacza, są związane z glikozylofosfatydyloinozytolem (GPI, ang. glycosylphosphatidylinositol) receptory CD55 (inaczej: DAF, ang. decay-accelerating factor) oraz CD59 (MIRL, ang. membrane inhibitor of reactive lysis). CD55 zapobiega opsonizacji komórek przez składowe C3, natomiast CD59 blokuje tworzenie kompleksu atakującego błonę (MAC, ang. membrane attack complex).

W nocnej napadowej hemoglobinurii (NNH) komórki krwi nie posiadają na swojej powierzchni białek CD55 i CD59 i są bardzo wrażliwe na zależną od dopełniacza lizę.

Molekularny mechanizm wystąpienia nocnej napadowej hemoglobinurii

Na skutek mutacji w genie PIGA dochodzi do nieprawidłowej syntezy łańcucha GPI, który kotwiczy na powierzchni komórek ponad 150 różnych cząsteczek. Zmieniona struktura fosfatydyloinozytolu uniemożliwia białkom błonowym związanym z GPI (GPI-AP, ang. GPI anchored proteins) wbudowanie do dwuwarstwy fospolipidowej, a przez to regulację aktywności dopełniacza i adhezji komórkowej [3].

Na powierzchni hematopoetycznej komórki macierzystej znajduje się około 30 białek z grupy GPI-AP. Są to zarówno antygeny grup krwi i cząsteczki adhezyjne, jak i białka dezaktywujące wpływ dopełniacza. Aby doszło do wystąpienia pełnoobjawowej nocnej napadowej hemoglobinurii, mutacje łańcucha GPI muszą wystąpić na poziomie komórki macierzystej, która osiągnie dominację klonalną. Wciąż nie ustalono, jakie mechanizmy prowadzą do klonalnej ekspansji i dominacji zmutowanych komórek macierzystych. Podejrzewa się, że ze względu na brak niektórych antygenów są one odporne na działanie mechanizmów autoimmunologicznych i cytotoksyczną aktywność komórek NK, a także nie wykazują wrażliwości na działanie INFγ i TNFα. Prawdopodobne jest też wystąpienie w klonie o zmienionym GPI innej, dodatkowej mutacji, która nadawałaby wielopotencjalnym komórkom krwiotwórczym zdolność do niezłośliwego, klonalnego rozrostu [4, 5].

Komórki krwi pozbawione CD55 i CD59 niszczone są na drodze alternatywnej aktywacji układu dopełniacza. Na ich powierzchni zwiększa się aktywność konwertazy C3, co prowadzi do zaktywowania składowych C3 i C5 i finalnie powstania kompleksu atakującego błonę komórkową. Niewyhamowane przed CD59 tworzenie kompleksu MAC prowadzi do rozpadu komórek [6].

Charakterystyka kliniczna

Najbardziej charakterystycznym dla NNH objawem jest anemia będąca skutkiem zarówno reakcji hemolitycznych, jak i dysfunkcji szpiku kostnego. W klasycznej postaci NNH często stwierdza się masywną hemolizę wewnątrznaczyniową z umiarkowaną lub ciężką niedokrwistością, podwyższoną liczbą retikulocytów i nawet 10-krotnym wzrostem aktywności dehydrogenazy mleczanowej (LDH). U części pacjentów stwierdza się niedokrwistość aplastyczną. Zanik prawidłowego utkania szpiku kostnego skutkuje zmniejszeniem liczby czerwonych krwinek, niedoborem leukocytów i ciężką trombocytopenią. Liczba retikulocytów jest natomiast niższa, nie występuje też podwyższenie aktywności LDH. W obrazie klasycznej NNH charakterystyczny jest też wysoki (> 50%) odsetek granulocytów pozbawionych CD55 i CD59. Morfologia krwi może być jednak prawidłowa, z niewielkim tylko obniżeniem liczby krwinek, a odsetek zmienionych granulocytów niski – jest to podstawą do stwierdzenia subklinicznej postaci choroby, która ma słabo wyrażone objawy i łagodny przebieg [4, 7].

Jednym z najpoważniejszych zagrożeń dla pacjentów z NNH jest zakrzepica. Incydenty zakrzepowo-zatorowe są główną przyczyną zgonów chorych na hemoglobinurię. Zakrzepy częściej tworzą się w krążeniu żylnym, stwierdza się je w żyłach wątrobowych (powszechny u chorych na NHH jest zespół Budda-Chariego), śledzionowych i w krezce, ale też naczyniach mózgu i płuc. Udar mózgu i zator płucny stanowią szczególnie niebezpieczne powikłania NNH [8].

Wśród przyczyn zakrzepicy wymienia się wewnątrznaczyniową agregację płytek krwi pozbawionych niektórych receptorów błonowych, a także ich aktywację indukowaną spadkiem stężenia tlenku azotu (NO). Niesprawnie działają też mechanizmy fibrynolizy wynikające z niedoboru niektórych białek związanych z GPI. Brak receptorów dla urokinazowego aktywatora plazminogenu i siarczanu heparanu na powierzchni trombocytów ogranicza działanie antykoagulacyjne tych związków [9]. Zaburzenia w hemostazie nasila również zaktywowany dopełniacz. Prozakrzepowe działanie składowej C5a dopełniacza polega na zwiększeniu stężenia cytokin zapalnych, które inicjują interakcje płytek krwi z komórkami śródbłonka. Wykazano, że zahamowanie aktywności dopełniacza jest najskuteczniejszą strategią przeciwdziałania zakrzepicy u pacjentów z NNH.

Wykrzepianie w żyłach nerkowych wraz z tworzeniem mikrozakrzepów w naczyniach włosowatych nerek i uszkadzającym wpływem uwolnionych z rozpadłych erytrocytów: wolnej hemoglobiny, hemu i żelaza, stanowią przyczynę częstych uszkodzeń nerek. U chorych na NNH może rozwinąć się też zespół Fanconiego, który manifestuje się zaburzeniami resorpcji aminokwasów, glukozy i fosforanów. Uszkodzenie nerek jest przyczyną śmierci 8-18% chorych na NNH [10, 11].

Wspomniane obniżenie stężenia NO w surowicy krwi wynika z szybkiego i nieodwracalnego wiązania tlenku azotu z wolną hemoglobiną. W prawidłowych warunkach wolna hemoglobina uwalniana po rozpadzie erytrocytów wiąże się z haptoglobiną i jest wyłapywana przez receptor CD163 na powierzchni komórek linii monocyto-makrofagowej, a następnie degradowana. W przebiegu NNH stężenie wolnej hemoglobiny jest jednak tak wysokie, że mechanizmy jej wyłapywania okazują się niewystarczające. Hemoglobina uwalniana w pobliżu komórek śródbłonka i do strefy podśródbłonkowej, a więc bezpośrednio do źródła wytwarzania NO, szybko wychwytuje tlenek azotu i wywołuje liczne dysfunkcje [12]. Spadek stężenia NO jest główną przyczyną zaburzeń w regulacji napięcia mięśniowego. NO to śródbłonkowy czynnik rozluźniający (EDRF, ang. endothelium-derived relax­ing factor), regulujący stan napięcia mięśni gładkich w naczyniach krwionośnych. U pacjentów z NNH częste jest nadciśnienie płucne spowodowane stałym skurczem naczyń, ale też przewlekłą zatorowością płucną. NO wpływa też na inne mięśnie gładkie. Dysfagia, silne bóle brzucha, zaburzenia erekcji związane są z zaburzeniami relaksacji mięśni gładkich [13].

Klasyfikacja

NNH różnicuje się w zależności od tego, czy w obrazie klinicznym dominuje niedokrwistość hemolityczna, czy niewydolność szpiku. Zgodnie z aktualnymi zaleceniami International PNH Interest Group wyróżnia się:

• Postać klasyczną, w której odsetek komórek zmienionych wynosi > 50%; szpik jest prawidłowy bądź dominuje w nim linia erytroidalna, a parametry biochemiczne znacznie przekraczają normy.
• Postać, której towarzyszy niewydolność szpiku; odsetek komórek NNH waha się tu w granicach 25-50%, w szpiku stwierdza się cechy cytopenii, niedokrwistości aplastycznej lub zespołu mielodysplastycznego, a parametry biochemiczne są jedynie lekko zaburzone.
• Postać subkliniczną, łagodną, w której niski (najczęściej < 1%) odsetek komórek nieprawidłowych nie manifestuje się klinicznie i nie daje odchyleń w badaniach biochemicznych, jednak któremu mogą towarzyszyć zespoły niewydolności szpiku [5, 14].

Diagnostyka

Rozwój medycyny pozwolił na opracowanie skutecznego schematu diagnostycznego NNH. Pierwszym etapem rozpoznania hemoglobinurii jest szczegółowy wywiad lekarski, w którym pacjenci najczęściej zgłaszają osłabienie, duszności, silne bóle brzucha, ciemne zabarwienie moczu. Anemię potwierdzają niskie stężenia hemoglobiny i niska liczba erytrocytów, które w rozmazie są różnokształtne (poikilocytoza), niejednolicie wybarwione (anizocytoza). W niektórych przypadkach w morfologii można stwierdzić również niskie odsetki leukocytów i płytek krwi, które są charakterystyczne dla rozwijającej się, towarzysząco do NNH, aplazji szpiku. Liczba retikulocytów może być wysoka, jeśli została uruchomiona wyrównawcza odnowa linii erytroidalnej, ale zahamowanie hematopoezy będzie manifestować się niską liczbą retikulocytów. Podejrzenie zmian w aktywności krwiotwórczej szpiku wymaga przeprowadzenia biopsji i oceny rozmazu. Szpik najczęściej jest bogatokomórkowy, można stwierdzić hiperplazję układu czerwonokrwinkowego, erytropoeza jest normoblastyczna. Należy jednak pamiętać, że w przypadku wystąpienia anemii aplastycznej komórkowość szpiku będzie niska, liczba komórek z każdej linii hematopoetycznej obniżona, jednak komórki zachowają prawidłowy wygląd. Atypowe komórki występują licznie w zespołach mielodysplastycznych, którym może towarzyszyć NNH [15, 16].

W badaniach biochemicznych zwraca uwagę podwyższone stężenie LDH i niskie, często nieoznaczalne wartości haptoglobiny. Ponadto stwierdza się hiperbilirubinemię i zmiany w stężeniu ferrytyny (wzrost stężenia po hemolizie, kiedy z hemoglobiny jest uwalniane żelazo; niskie wartości przy niedoborach żelaza spowodowanych masywną hemolizą lub długotrwałą anemią) [17].

Test antyglobulinowy Coombsa jest w NNH ujemny, co pozwala zróżnicować napadową hemoglobinurię z niedokrwistościami hemolitycznymi o podłożu autoimmunologicznym. Wynik pozytywny dają natomiast, już historyczny, test Hama z zakwaszoną surowicą i test sacharozowy. Niskie pH podnosi aktywność układu dopełniacza i nasila lizę komórek. Obniżenie pH krwi może być indukowane szeregiem czynników, wpływają na nie: dieta, stres, wysiłek fizyczny, ciąża czy stosowanie niektórych leków. Fizjologiczne obniżenie pH krwi zachodzi również nocą, podczas snu, kiedy spowolniony oddech zatrzymuje dwutlenek węgla w krążeniu. Wraz ze wzrostem ciśnienia parcjalnego CO₂ obniża się pH krwi, przez co staje się ona bardziej kwaśna, a liza komórek nasila się – stąd myląca nazwa nocnej napadowej hemoglobinurii [18].

Współcześnie „złotym standardem” w diagnostyce NNH jest analiza cytometryczna. Cytometr przepływowy pozwala, przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, wykryć i zidentyfikować białka leżące na powierzchni analizowanych komórek. Zastosowanie techniki FLAER (fluorescent labelled aerolysin) dodatkowo zwiększyło czułość i swoistość analizy cytometrycznej. FLAER wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie toksyny Aeromonas hydrophila, które wiążą się do białek grupy GDI-AP i wywołują lizę komórek. Pozwala to wyodrębnić do analizy te komórki, które pozbawione białek sprzężonych z glikofosfatydyloinozytolem nie ulegają rozpadowi. Badanie przeprowadza się na co najmniej dwóch liniach komórkowych, w tym obligatoryjnie na granulocytach, które mimo fenotypu NNH długo utrzymują się w krążeniu. Poszczególne populacje komórek grupuje się z wykorzystaniem przeciwciał skierowanych przeciwko liniowym antygenom powierzchniowym, charakterystycznym dla każdego typu komórek. Wykrycie komórek nieprawidłowych wymaga ustalenia stopnia niedoboru CD55 i CD58 na ich powierzchni i oceny wielkości zmutowanego klonu. Szczególnie istotne jest wyznaczenie odsetka zmutowanych erytrocytów i stałe monitorowanie zmienionego klonu komórkowego, tak aby uprzedzić jego niekontrolowany rozrost [5, 19].

W celu pogłębienia diagnostyki i w przypadkach niejednoznacznych możliwe jest również przeprowadzenie badań genetycznych, wykrywających mutację genu PIGA. Natomiast w celu wykrycia i profilaktyki powikłań NNH wykorzystuje się badania obrazowe. USG jamy brzusznej pozwala ocenić ryzyko kamicy żółciowej, USG Doppler potwierdzić podejrzenie zakrzepicy kończyn dolnych, a tomografia komputerowa jest niezbędna dla diagnostyki zatorowości płucnej.

Leczenie

Leczenie hemoglobinurii jest trudne i rzadko skuteczne, a 5-letnią przeżywalność szacuje się na 35%. Główną przyczyną zgonów są ciężkie powikłania NNH obejmujące chorobę zakrzepową i niewydolność nerek [20]. Terapia skupia się głównie na łagodzeniu powikłań NNH, tj. profilaktyce zakrzepicy i leczeniu anemii, przez suplementację witaminy B12 i kwasu foliowego, ale też transfuzje.

Jednym z najskuteczniejszych leków, pozwalających na ograniczenie skutków choroby, jest ekulizumab. To przeciwciało monoklonalne, skierowane przeciwko składowej C5, blokujące końcowy etap aktywacji dopełniacza [21]. Jednak ze względu na możliwe efekty uboczne (głównie zakażenia, związane z wyciszeniem aktywności dopełniacza), brak odpowiedzi na leczenie u niektórych pacjentów i bardzo wysokie koszty terapii (roczny koszt leczenia pacjenta szacowany jest na 2 mln zł − w Polsce lek jest refundowany) jej dostępność jest ograniczona.

Skuteczne i trwałe wyleczenie pacjentów jest możliwe po przeszczepie szpiku kostnego. Allogeniczny przeszczep komórek krwiotwórczych wymaga jednak doboru odpowiedniego dawcy i niesie ze sobą ryzyko niebezpiecznych powikłań związanych głównie z spadkiem odporności. Ta metoda leczenia jest więc dedykowana jedynie pacjentom, którzy nie reagują na leczenie biologiczne, są narażeni na częste incydenty zakrzepowo-zatorowe oporne na leczenie przeciwzakrzepowe i u których towarzysząco do NNH rozwinęła się niewydolność szpiku [17, 22, 23].

Piśmiennictwo

1. Noris M., Remuzzi G.: Overview of complement activation and regulation. „Semin Nephrol.”, 2013, 33 (6), 479-492.

2. Klaska I., Nowak J.: Rola układu dopełniacza w fizjologii i patologii. „Postępy Hig Med Dośw”, 2007, 61, 167-177.

3. Luzzatto L.: PNH from mutations of another PIG gene. „Blood”, 2013, 122, 1099-1100.

4. Brodsky R.A.: Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. „Blood”, 2014, 124, 2804-2811.

5. Spychalska J., Brojer E.: Nocna napadowa hemoglobinuria − patofizjologia, klasyfikacja i nowoczesna diagnostyka. „Hematologia”, 2013, 4, 301-320.

6. Schrezenmeier H. et al.: Baseline characteristics and disease burden in patients in the International Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria Registry. „Haematologica”, 2014, 99, 922-929.

7. Żupańska B., Spychalska J., Pyl A., Mendek-Czajkowska E., Brojer E.: Nocna napadowa hemoglobinuria − wieloletnie obserwacje. Charakterystyka kliniczna i analiza wielkości klonu z defektem kotwicy glikozylofosfatydyloinozytolowej (GPI). „Acta Haematol. Pol.”, 2012, 43, 75-82.

8. Hill A., Kelly R.J., Hillmen P.: Thrombosis in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. „Blood”, 2013, 121, 4985-4996.

9. Maślanka K.: Udział płytek krwi w procesach zapalnych. „J. Transf. Med.”, 2014, 7, 102-109.

10. Karwacki M. i wsp.: Nocna napadowa hemoglobinuria u dzieci jako przykład rzadkich schorzeń ukrywających się pod różnymi maskami rozpoznań klinicznych. Dylematy kliniczne, etyczne i społeczne rozpoznawania chorób ultrarzadkich na kanwie przypadku. „Nowa Pediatr”, 2019, 23 (1), 51-58.

11. Piekarska A., Spychalska J.: Nowe spojrzenie na nocną napadową hemoglobinurię. „Hematologia”, 2015, 6, 3, 278-292.

12. Misztal T., Tomasiak M.: Patofizjologiczne konsekwencje hemolizy. Rola wolnej hemoglobiny. „Postepy Hig Med Dosw”, 2011, 65, 627-639.

13. Hill A., Sapsford R.J., Scally A. et al.: Under-recognized complications in patients with paroxysmal nocturnal haemoglobinuria: raised pulmonary pressure and reduced right ventricular function. „Br. J. Haematol.”, 2012, 158, 409-414.

14. de Latour R. et al.: Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: natural history of disease subcategories. „Blood”, 2008, 112, 3099-3106.

15. Barcellini W., Fattizzo B.: Clinical Applications of Hemolytic Markers in the Differential Diagnosis and Management of Hemolytic Anemia. „Disease Markers”, 2015, 635-70.

16. Ciepela O.: Laboratoryjna diagnostyka nieimmunologicznych niedokrwistości hemolitycznych – membranopatie. „Współczesna Medycyna Laboratoryjna”, 2019, 1 (1), 16-21.

17. Boguradzki A., Hoffman A.: Nocna napadowa hemoglobinuria – od teorii do praktyki klinicznej. „Onkologia po Dyplomie”, 2017, 5, 1-5.

18. Parker Ch.: Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria: An Historical Overview. „Hematology Am Soc Hematol Educ Program”, 2008, 1, 93-103.

19. Borowitz M.J., Craig F.E., DiGiuseppe J.A. et al.: Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry. „Cytometry Part B”, 2010, 78B, 211-228.

20. Jang J.H., Kim J.S., Yoon S.S. et al.: Predictive Factors of Mortality in Population of Patients with Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria (PNH): Results from a Korean PNH Registry. „J Korean Med Sci.”, 2016, 31 (2), 214-221.

21. Ekulizumab (Soliris^®) w leczeniu napadowej nocnej hemoglobinurii. Analiza kliniczna. Warszawa, październik 2015.

22. Peffault de Latour R., Schrezenmeier H., Bacigalupo A. et al.: Allogeneic stem cell transplantation in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. „Haematologica”, 2012, 97 (11), 1666-73.

23. Sahin F., Saydam G.: PESG PNH diagnosis, follow-up and treatment guidelines. „Am J Blood Res”, 2016, 6 (2), 19-27.