Toxoplasma gondii należy do obligatoryjnych, poliksenicznych, wewnątrzkomórkowych pierwotniaków wywołujących odzwierzęcą chorobę pasożytniczą – toksoplazmozę. Diagnostyka zarażenia T. gondii opiera się na:
•    metodach bezpośrednich, umożliwiających wykrycie pasożyta lub jego materiału genetycznego;
•    metodach pośrednich, polegających na wykrywaniu swoistych przeciwciał [1, 3].
Rutynowa diagnostyka laboratoryjna toksoplazmozy opiera się głównie na badaniach serologicznych, za pomocą których są wykrywane w surowicy lub w płynach ustrojowych specyficzne przeciwciała anty-T. gondii w klasach IgG, IgM oraz rzadziej IgA [4]. Metody te charakteryzuje dość wysoka czułość i swoistość, a także powszechna dostępność i niewysokie koszty (tab. 1) [5-8].

Dynamika pojawiania się przeciwciał anty-T. gondii  

Już w 1. tygodniu po zarażeniu zostaje uruchomiona produkcja przeciwciał klasy IgM. Na początku ich stężenie dynamicznie wzrasta, a następnie ok. 6.-9. miesiąca stopniowo maleje i może się utrzymywać na niewysokim poziomie do 12 lat. Ze względu na to, że przeciwciała te mogą występować także u osób w przewlekłym stadium choroby, obecnie te przeciwciała nie są uznawane za wykładnik początkowej fazy toksoplazmozy. Przeciwciała klasy IgA wytwarzane są w tym samym czasie, co przeciwciała IgM i mogą być wykrywane nawet po 3 latach od zarażenia. Przeciwciała klasy IgG pojawiają się ok. 6.-8. tygodnia od momentu inwazji; w 3.-6. miesiącu ich stężenie jest najwyższe i stan ten utrzymuje się przez kilka miesięcy. Następnie poziom IgG spada, by w niewielkim stężeniu pozostać w organizmie do końca życia [5, 6].

Test awidności  

Aby ustalić czas, jaki upłynął od momentu zarażenia i zdefiniować fazę choroby, stosuje się test awidności. Polega on na określeniu siły, z jaką przeciwciała klasy IgG wiążą antygeny T. gondii. Od niedawna to badanie zaczęto również wykorzystywać do odróżniania niedawno nabytego zarażenia od nawrotu toksoplazmozy w przebiegu m.in. opryszczki, gruźlicy, zapalenia wątroby typu C czy paragrypy [9].

Badanie metodą biologii molekularnej  

W przypadku wyników budzących wątpliwości, otrzymanych metodami immunoserologicznymi, można zastosować badanie metodą PCR (ang. polymerase chain reaction, łańcuchowa reakcja polimerazy), które pozwala wykryć antygeny T. gondii do
2-3 tygodni od inwazji pasożyta [2].
Reakcja PCR wykrywa 35-nukleotydowy fragment DNA T. gondii, określany jako gen B1, we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym do 2-3 tygodni od zarażenia. Jest to metoda diagnostyczna o wysokiej swoistości i czułości (odpowiednio 98,9% i 99%), ponieważ DNA jest niezmienne przez cały cykl życiowy pasożyta. Niewielka ilość materiału oraz krótki czas oczekiwania są dodatkowymi zaletami tej metody. Należy jednak zwrócić uwagę, że powielany DNA może pochodzić zarówno od tachyzoitów (obecnych w inwazji ostrej), jak i cyst (występujących w fazie przewlekłej), dlatego oparcie diagnostyki tylko na tej technice jest błędem. Ponadto dodatni wynik PCR może pojawić się w przypadku pasożytów unieszkodliwionych w wyniku leczenia [2, 3].

Nowe perspektywy diagnostyczne  

Skuteczną metodą przesiewową wykazującą 100% czułości i swoistości jest nowy test przesiewowy Toxoplasma ICT IgG-IgM POC, pozwalający na zróżnicowanie pozytywnych IgG/IgM od negatywnych surowic. Jego wykonanie jest proste i szybkie, a także niedrogie [10]. Test ten, choć nie jest jeszcze rutynowo stosowany, użyty został we Francji jako badanie przesiewowe dla kobiet nieposiadających w krwi swoistych przeciwciał przeciwko T. gondii, a będących w grupie ryzyka zarażenia. Jest on oparty na immunochromatografii i pozwala na jednoczesne wykrycie swoistych IgG i IgM [11].

Diagnostyka T. gondii w ciąży i u noworodków  

Pomimo że w Polsce nie przeprowadza się rutynowych badań skryningowych w kierunku zarażenia T. gondii, to coraz większa liczba lekarzy zleca ciężarnym pacjentkom wykonanie odpowiednich badań. Według zaleceń Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego wskazane jest, aby między 7.-8. tygodniem ciąży (do 10. t.c.) oznaczyć przeciwciała klasy IgG i IgM. Między 21.-26. tygodniem ciąży należy ponowić badania u kobiet, które w I trymestrze ciąży miały wynik ujemny [12]. W przypadku wyników wątpliwych można wykonać testy dodatkowe, takie jak oznaczenie stężenia przeciwciał klasy IgA, a także test awidności przeciwciał klasy IgG. W przypadku kobiet, u których nie wykryto przeciwciał przeciwko T. gondii, zalecane są badania kontrolne co ok. 3 miesiące [1].
W diagnostyce noworodków przydatne są badania mające na celu wykrycie pasożyta, jego DNA lub antygenów, a materiałem do badań może być krew pępowinowa, łożysko lub wody płodowe. Diagnostyka toksoplazmozy wrodzonej opiera się również na regularnym oznaczaniu stężenia przeciwciał klas IgG, IgM i IgA. Ma to na celu monitorowanie dynamiki narastania i spadku stężenia przeciwciał. Pierwszego pomiaru dokonuje się tuż
po porodzie zarówno u matki, jak i u dziecka, a następnie co 3-4 tygodnie do 6. miesiąca życia. Obecność przeciwciał, które nie przechodzą przez łożysko, czyli klasy IgM lub IgA,
w surowicy noworodka stanowi potwierdzenie czynnej toksoplazmozy. Natomiast obecność przeciwciał klasy IgG, które swobodnie przenikają przez łożysko, nie może być traktowana jako wskaźnik zarażenia [13].

Diagnostyka toksoplazmozy ośrodkowego układu nerwowego 

Toksoplazmoza ośrodkowego układu nerwowego (OUN), tzw. neurotoksoplazmoza, rozwija się u osób przyjmujących leki immunosupresyjne, chorych na AIDS czy nowotwory. Rutynowa diagnostyka laboratoryjna w przypadku tych chorych obejmuje testy serologiczne oraz badanie płynu mózgowo-rdzeniowego. Ponadto wykonuje się tomografię komputerową (TK) i RTG. Ze względu na fakt, że wynik TK oraz objawy kliniczne są zazwyczaj mało charakterystyczne, a odczyn serologiczny może być niejednoznaczny, o ostatecznym rozpoznaniu neurotokspolazmozy decyduje badanie płynu mózgowo-rdzeniowego, w którym stwierdza się obecność trofozoitów lub ich krążących antygenów w badaniu bezpośrednim oraz badanie PCR wykrywające DNA pasożyta [13].
Badanie płynu mózgowo-rdzeniowego (obok oceny neurologicznej, badań obrazowych, badania audiologicznego i badania dna oka) powinno być wykonane w przypadku diagnostyki w kierunku wrodzonego zarażenia T. gondii u noworodków [3]. Wynik badania laboratoryjnego płynu mózgowo-rdzeniowego będzie wskazywał podwyższoną cytozę (norma u noworodka: 0-30 komórek/µL), wzrost stężenia białka całkowitego (norma u noworodka: 15-100 mg/dL), niewielkie obniżenie stężenia glukozy (norma: 50-80 mg/dL), a w rozmazie barwionym metodą May Grünwalda-Giemsy będą dominowały komórki jednojądrzaste.
Ze względu na wyniki fałszywie ujemne, często występujące w stanach obniżonej odporności, neurotoksoplazmozie, toksoplazmozie ocznej i u niemowląt, oraz niejednoznaczność badań serologicznych (swoistość testu 28-47%, czułość 97%), niezbędne jest pogłębienie diagnostyki. Oznacza się wówczas i porównuje stężenia przeciwciał w płynie mózgowo-rdzeniowym i w surowicy. Wyliczony na ich podstawie wskaźnik Patasmana umożliwia postawienie właściwego rozpoznania (≥ 8 dla toksoplazmozy ocznej, ≥ 4 dla zarażeń wrodzonych OUN) [2, 13]. Diagnostykę można także pogłębić, wykorzystując badania technikami biologii molekularnej, spośród których główną metodą jest łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) [2, 3]. W przypadku diagnostyki płynu mózgowo-rdzeniowego istotnym etapem jest odpowiedni dobór metody izolacji DNA, mający duży wpływ na wynik amplifikacji fragmentów genu B1 T. gondii w reakcji PCR. Wykazano, że spośród trzech metod stosowanych do izolacji (enzymatycznej, termicznej oraz enzymatyczno-filtracyjnej) najwydajniejszą okazała się metoda enzymatyczna, która umożliwia wykrycie DNA w 50% próbek zawierających jednego pasożyta [14]. Udowodniono również, że obecność więcej niż 4 zmian ogniskowych w mózgu oraz cytoza ≥ 4 komórek/µl zwiększają czułość metody PCR w wykrywaniu DNA T. gondii w płynie mózgowo-rdzeniowym [15].

Podsumowanie  

W 2011 r. Instytut Chorób Zakaźnych Emilio Ribas w São Paulo przeprowadził badania dotyczące antygenu ESA (ang. excretory-secretory antigen) wytwarzanego przez tachyzoity – formę odpowiedzialną za rozprzestrzenianie inwazji. Analizie metodą ELISA i immunoblottingu poddano 270 próbek płynu mózgowo-rdzeniowego pacjentów zarażonych wirusem HIV (w tym 99 pacjentów z toksoplazmozą mózgu, 112 z dodatnim odczynem serologicznym na T. gondii i inną oportunistyczną chorobą neurologiczną oraz 59 z ujemnym odczynem serologicznym i inną oportunistyczną chorobą neurologiczną). Wykazano, że w płynie mózgowo-rdzeniowym u ponad 50% pacjentów z toksoplazmozą mózgu występują przeciwciała swoiste anty-ESA. Okazało się, że powyższe metody w połączeniu z badaniami serologicznymi i radiologicznymi są szczególnie przydatne w diagnozowaniu populacji narażonych na toksoplazmozę utajoną [16].    

Piśmiennictwo
1.    Drapała D., Holec-Gąsior L.: Diagnostyka toksoplazmozy u kobiety ciężarnej, płodu i noworodka – stan obecny i nowe możliwości. „Forum Medycyny Rodzinnej”, 2013,
7 (4), 176-184.
2.    Włodarczyk A., Lass A., Witkowski J.: Toksoplazmoza – fakty i mity. „Forum Medycyny Rodzinnej”, 2013, 7 (4), 165-175.
3.    Niezgoda A., Dobrzańska A.: Toksoplazmoza wrodzona – rozpoznawanie i leczenie. „Przewodnik Lekarza”, 2008, 2, 44-50.
4.    Holec-Gąsior L., Kur J.: Nowe testy diagnostyczne oparte o antygeny rekombinantowe Toxoplasma gondii do wykrywania oraz różnicowania fazy wczesnej i przewlekłej toksoplazmozy. „Postępy Polskiej Medycyny i Farmacji”, 2011, 1 (1), 39-47.
5.    Śpiewak E.: Wykorzystanie serologicznych metod w rozpoznawaniu zarażeń Toksoplazma gondii u kobiet w ciąży. „Perinatologia, Neonatologia i Ginekologia”, 2009, 2 (3), 223-226.
6.    Holec-Gąsior L., Lautenbach D., Drapała D., Kur J.: Prawidłowe rozpoznanie toksoplazmozy u kobiet ciężarnych – ważność badań diagnostycznych oraz nowe możliwości. „Forum Medycyny Rodzinnej”, 2010, 4 (4), 255-262.
7.    Milewska-Bobula B., Lipka B.: Diagnostyka oraz leczenie noworodków i niemowląt z wrodzoną toksoplazmozą – z perspektywy lekarza pediatry. „Perinatologia, Neonatologia i Ginekologia”, 2010, 3 (2), 124-128.
8.    Holec-Gąsior L., Drapała D.: Awidność przeciwciał IgG jako ważny test diagnostyczny w rozpoznawaniu aktywnej toksoplazmozy – stan obecny i nowe możliwości. „Forum Medycyny Rodzinnej”, 2012, 6 (2), 74-81.
9.    Adamek B., Olszok I., Bluszcz-Rożnowska A., Kasperczyk J., Zalewska-Ziob M., Wiczkowski A.: Awidność przeciwciał przeciwko Toxoplasma gondii – parametr przydatny w diagnostyce różnicowej. „Problemy Medycyny Rodzinnej”, 2009, 11 (1), 46-50.
10.    Begeman I.J., Lykins J., Zhou Y., Lai B.S. et al.: Point-of-care testing for Toxoplasma gondii IgG/IgM using Toxoplasma ICT IgG-IgM test with sera from the United States and implications for developing countries. PLOS Neglected Tropical Diseases 2017, 11 (6).
11.    Chapey E., Wallon M., Peyron F.: Evaluation of the LDBIO point of care test for the combined detection of toxoplasmic IgG and IgM. „Clinica Chimica Acta”, 2016, 464, 200-201.
12.    Rekomendacje Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego w zakresie opieki przedporodowej w ciąży o prawidłowym przebiegu. Polskie Towarzystwo Ginekologiczne, 2005.
13.    Kruszewski J., Miller A.: Toksoplazmoza. „Alergia”, 2004, 2, 30-37.
14.    Gołąb E., Waloch M.: Łancuchowa reakcja polimerazy w diagnostyce toksoplazmozy ośrodkowego ukladu nerwowego – wpływ metody izolacji DNA z próbek płynu mózgowo-rdzeniowego na wynik reakcji. „Medycyna Doświadczalna i Mikrobiologia”, 2002, 54 (1), 87-91.
15.    Correia Cda C., Melo H.R., Costa V.M., Brainer A.M.: Features to validate cerebral toxoplasmosis. „Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical”, 2013, 46 (3), 373-376.
16.    Meira C.S., Vidal J.E., Costa-Silva T.A., Frazatti-Gallina N., Pereira-Chioccola V.L.: Immunodiagnosis in cerebrospinal fluid of cerebral toxoplasmosis and HIV-infected patients using Toxoplasma gondii excreted/secreted antigens. „Diagnostic Microbiology and Infectious Disease”, 2011, 71 (3), 279-285.