fot. Istock

TITLE:

Umbilical cord blood: collection, processing, storage

STRESZCZENIE:

Krew pępowinowa jest źródłem hematopoetycznych komórek macierzystych. Zanim stwierdzono jej przydatność w medycynie, była traktowana jako odpad medyczny i wraz z łożyskiem trafiała do utylizacji. Ze względu na unikatowe właściwości, komórki macierzyste izolowane z krwi pępowinowej znajdują coraz większe zastosowanie w terapiach. Obecnie z ich wykorzystaniem leczy się ponad 70 różnych schorzeń, m.in.: nowotwory hematologiczne, nienowotworowe choroby układu krwiotwórczego, choroby autoimmunologiczne i dziedziczne. Proces pozyskania krwi pępowinowej jest bezpieczny zarówno dla matki, jak i dziecka. Niniejsze opracowanie opisuje proces pozyskania krwi pępowinowej oraz jej preparatyki i przechowywania na podstawie działalności Publicznego Banku Komórek Macierzystych Regionalnego Centrum Naukowo-Technologicznego.

SŁOWA KLUCZOWE:

krew pępowinowa, hematopoetyczne komórki macierzyste, pozyskiwanie

SUMMARY:

Umbilical cord blood is a source of haematopoietic stem cells. Before this biospecimen has been proven to be useful in medicine, it was treated as medical waste and disposed of along with the placenta. Due to their unique properties, stem cells isolated from umbilical cord blood are being increasingly widely applied in therapies. Currently, they are used to treat over 70 different diseases, e.g. haematological cancers, non-cancerous haematopoietic diseases, autoimmune, and hereditary diseases. The process of obtaining umbilical cord blood is safe for both mother and child. This paper describes the process of collecting umbilical cord blood as well as its preparation and storage based on the operations of the Public Stem Cell Bank of the Regional Science and Technology Centre.

KEYWORDS:

umbilical cord blood, haematopoietic stem cell, collection

W ciągu ostatnich kilkunastu lat nastąpił istotny rozwój medycyny transplantacyjnej, a tym samym wzrosło zainteresowanie bankowaniem krwi pępowinowej, która jest alternatywnym, obok szpiku kostnego oraz mobilizowanej krwi obwodowej, źródłem hematopoetycznych komórek macierzystych układu krwiotwórczego. Zanim stwierdzono jej przydatność w terapii różnych chorób, była traktowana jako odpad medyczny i trafiała do utylizacji. Hematopoetyczne komórki macierzyste stanowią od 0,02 do 1,42% całkowitej liczby komórek [1, 2]. Pierwszego przeszczepu komórek macierzystych wyizolowanych z krwi pępowinowej dokonano w Paryżu w 1988 r. Biorcą był chłopiec chory na anemię Fanconiego, a dawcą materiału jego siostra. Po kilku dniach od transplantacji stwierdzono znaczącą poprawę stanu zdrowia chorego [3, 4]. Po tym osiągnięciu nastąpił gwałtowny wzrost zainteresowania naukowców nad potencjałem terapeutycznym komórek macierzystych z krwi pępowinowej. Obecnie na świecie z wykorzystaniem hematopoetycznych komórek macierzystych krwi pępowinowej leczy się ponad 70 różnych jednostek chorobowych. Są to głównie: nienowotworowe choroby układu krwiotwórczego, nowotwory hematologiczne, schorzenia autoimmunologiczne i dziedziczne. Przeszczepów najczęściej dokonywano u osób chorych na: ostrą białaczkę (37%), talasemię lub chorobę sierpowatą (29%), anemię Fanconiego (7%) zaburzenia metaboliczne i immunologiczne (18%) [5, 6]. W skład krwi pępowinowej wchodzą także niekrwiotwórcze komórki, z których najliczniejsze stanowią: mezenchymalne komórki macierzyste posiadające zdolność do różnicowania w adipocyty, chondrocyty oraz osteocyty. Fakt ten przyczynił się do rozwoju badań nad ich wykorzystaniem w medycynie regeneracyjnej [7].

W rezultacie obserwuje się wzrost liczby jednostek zajmujących się procesowaniem i przechowywaniem krwi pępowinowej. Pierwszy Publiczny Bank Komórek Macierzystych został otworzony w 1988 roku w Nowym Jorku. Obecnie takich jednostek jest już 158 w 36 krajach na całym świecie [8]. Do 2013 roku zgromadzono około 600 000 preparatów komórek macierzystych dostępnych dla niespokrewnionych biorców oraz wykonano 30 000 przeszczepień [9]. Idee publicznego bankowania krwi pępowinowej popiera także Europejski Komitet Zdrowia przy Radzie Europy. Parlament Europejski w swojej rezolucji z 2012 roku nawołuje do dobrowolnego i nieodpłatnego dawstwa tkanek oraz komórek w celu zwiększenia szansy na znalezienie niespokrewnionego biorcy, a tym samym na pomoc w ratowaniu życia. Z danych przedstawionych w Projekcie Rezolucji Parlamentu Europejskiego wynika, że w całej Unii Europejskiej pobór krwi pępowinowej następuje tylko w trakcie 1% wszystkich porodów. Tak mała liczba pobrań ogranicza perspektywę stosowania komórek macierzystych w terapii [10].

W zależności od wyboru rodziców, komórki macierzyste z krwi pępowinowej mogą być deponowane w banku rodzinnym bądź publicznym. Banki rodzinne przechowują preparaty komórek macierzystych na zlecenie rodziców, którzy są wyłącznymi jej dysponentami. Wiąże się to jednocześnie z pokryciem kosztów: procesu pozyskania krwi pępowinowej, izolacji frakcji leukocytarnej będącej źródłem komórek macierzystych oraz przechowywania. Banki publiczne przechowują preparaty komórek macierzystych, zwiększając tym samym pulę preparatów dostępnych dla biorców niespokrewnionych [11].

Zastosowanie komórek macierzystych z krwi pępowinowej

Krew pępowinowa jest wysoce niejednorodną mieszaniną komórek. Zawiera ona głównie komórki układu krwiotwórczego, w tym: leukocyty, erytrocyty oraz trombocyty. Ponadto krew pępowinowa zawiera co najmniej trzy typy komórek macierzystych, w tym populację hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) stanowiących od 0,02 do 1,42% całkowitej liczby komórek. Poza nimi w krwi pępowinowej znajdują się także niekrwiotwórcze multipotentne komórki macierzyste oraz mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) [1, 12].

Krwiotwórcze komórki macierzyste są prekursorami wszystkich linii hematpoezy w warunkach in vivo, jak i in vitro, różnicują się w: granulocyty, monocyty, leukocyty, erytrocyty, megakariocyty oraz limfocyty zarówno B, jak i limfocyty T. Posiadają one także zdolność do samoodnowy, dzięki czemu utrzymują stałą pulę komórek pluripotencjalnych, począwszy od rozwoju embrionalnego, przez całe życie osobnika. Hematopoetyczne komórki macierzyste dzielą się bez zaburzeń funkcjonalnych i strukturalnych dzięki znaczącej aktywności telomerazy. Charakteryzuje je także wysoki poziom białek MDR (oporności wielolekowej) oraz dehydrogenazy alkoholowej. Hematopoetyczne komórki macierzyste pozostają w fazie cyklu G0, o czym może świadczyć nieznaczne zabarwienie Hoechst33342 będącego barwnikiem kwasów nukleinowych [13, 14].

Komórki macierzyste z krwi pępowinowej są głównie wykorzystywane w chorobach hematologicznych. Do chorób, które są już leczone komórkami macierzystymi z krwi pępowinowej, możemy zaliczyć: ostre białaczki (m.in.: ostra białaczka limfoblastyczna, ostra białaczka szpikowa, ostra białaczka małozróżnicowana), zespoły mielodysplastyczne, zaburzenia mieloproliferacyjne, nadpłytkowość samoistną, choroby fagocytów (niedobór aktyny neutrofilowej, dysgeneza retikularna), dziedziczne zaburzenia metaboliczne, mukopolisacharydozę. Preparaty komórek macierzystych z krwi pępowinowej są także wykorzystywane w terapii dziedzicznych zaburzeń układu immunologicznego, np.: niedobór adhezji leukocytów, zespół DiGeorga, dziedzicznych nieprawidłowości płytek krwi (małopłytkowość wrodzona), a także nowotworów narządowych [15, 16].

Komórki macierzyste są także obiecującym kandydatem do leczenia przewlekłej choroby metabolicznej, czyli cukrzycy typu 1 T1D [17]. Badania na zwierzętach pokazują, że komórki macierzyste z krwi pępowinowej mogą pomagać w regeneracji β wysp trzustkowych. Limfocyty T izolowano od myszy chorych na jawną postać cukrzycy, a następnie inkubowano wraz z komórkami macierzystymi przez 2-4 dni. Po tym czasie limfocyty T wprowadzano do chorych zwierząt. Dzięki temu protokołowi zaobserwowano spadek hiperglikemii, aktywację regeneracji wysp β trzustkowych, efektami były także wzmożona produkcja insuliny i przywrócenie równowagi cytokin Th1/Th2 [1].

Mezenchymalne komórki macierzyste są rokującym kandydatem do zastosowania w regeneracji mięśnia sercowego. Przeprowadzono szereg badań wskazujących na możliwość zastosowania tych komórek do: zmniejszania blizn w miokardium, przywracania prawidłowej czynności skurczowej, polepszania miejscowej i całościowej funkcji komór w przypadku zawału mięśnia sercowego oraz kardiomiopatii niedokrwiennej [18]. Niektóre badania na myszach sugerują, że MSC mogą ułatwiać formowanie się nowych naczyń krwionośnych w procesie zwanym neowaskularyzacją. Same MSC nie tworzą nowych komórek naczyń krwionośnych, ale pomagają w tym procesie na wiele sposobów, np. mogą wydzielać białka, które stymulują inne komórki, zwane prekursorami endothelium, które to tworzą wewnętrzną warstwę naczyń krwionośnych. Tego typu badania na zwierzętach dały naukowcom nadzieję na to, że MSC mogą się przyczyniać do naprawy uszkodzonych naczyń krwionośnych po ataku serca lub w schorzeniach takich jak niedokrwistość kończyn [19].

Ostatnie badania wskazują, że transplantacja mezenchymalnych komórek macierzystych wywiera ochronne działanie na organizm w przypadku cukrzycy. Badania na modelu zwierzęcym z cukrzycą indukowaną pokazały, że MSC pochodzące ze szpiku kostnego podane dożylnie docierały do trzustki i znacznie obniżały poziom glukozy we krwi. Podwyższał się natomiast poziom insuliny w surowicy krwi. Badania histologiczne wykazały, że MSC zasiedlały uszkodzone miejsce w trzustce i promowały produkowanie komórek wytwarzających insulinę pochodzących od biorcy. Działanie to prawdopodobnie było wywołane poprzez związki wydzielane przez komórki macierzyste. Pojawiły się także doniesienia, że to same MSC wykazują zdolność do różnicowania się w komórki wytwarzające insulinę. Podobne wyniki otrzymano przy zastosowaniu MSC wyizolowanych z galarety Whartona. Komórki te posiadały zdolność różnicowania w kierunku komórek przypominających dojrzałe komórki wysp trzustkowych, zdolne do wytwarzania insuliny in vitro i in vivo [20].

Mezenchymalne komórki macierzyste mogą mieć zastosowanie także w leczeniu innych schorzeń: chorób neurologicznych (stwardnienie rozsiane, stwardnienie zanikowe boczne, autyzm), chorób wątroby i pęcherza moczowego, a także w leczeniu przewlekłych ran. Podejmowane są także próby wykorzystania własnych MSC pacjenta do odtwarzania uszkodzonych odcinków dróg oddechowych. Terapia komórkowa z wykorzystaniem MSC należy do bezpiecznych, ponieważ komórki te, w stanie niezróżnicowanym, nie przyczyniają się do powstania potworniaków − guzów, które mogą powstać w przypadku wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych [14].

Pozyskiwanie krwi pępowinowej

Pozyskiwanie krwi pępowinowej jest procesem nieinwazyjnym, niestwarzającym zagrożeń dla matki ani dziecka. Jest wykonywane podczas porodu fizjologicznego, cesarskiego cięcia, zarówno w przypadku ciąży pojedynczej, jak i mnogiej. Porcje krwi pępowinowej pozyskiwane są przez przeszkolony w tym zakresie personel medyczny. Łożysko po wydaleniu jest umieszczane w jałowym podkładzie chirurgicznym na wysokości około 1 m (możne być zawieszone na stojaku do kroplówek, umieszczone w specjalnym stelażu do pozyskiwania krwi pępowinowej metodą ex utero lub uniesione w rękach przy pomocy osoby asystującej). Proces pozyskiwania krwi pępowinowej jest krytyczny z punktu widzenia zakażenia materiału drobnoustrojami, prawdopodobnie sposób pozyskiwania ma wpływ także na ilość i jakość pobranych komórek [11]. W związku z powyższym pępowina jest dezynfekowana 70-proc. alkoholem etylowym lub 0,2-proc. roztworem chloroheksydyny w celu minimalizowania ryzyka kontaminacji. Dodatkowym zabezpieczeniem przed zakażeniem próbki jest zmiana rękawiczek na sterylne pomiędzy dezynfekcją pępowiny a pozyskaniem krwi pępowinowej. Żyła pępowinowa nakłuwana jest w części dystalnej pępowiny. Krew pępowinowa jest pozyskiwana poprzez grawitacyjny wypływ do komercyjnie dostępnych aseptycznych worków kolekcyjnych, zawierających antykoagulant CPD lub CPDA1. Po pozyskaniu pojemnik z materiałem biologicznym jest umieszczany w zestawie do transportu krwi pępowinowej, którego kluczowym elementem jest rejestrator temperatury zapewniający stały monitoring warunków do czasu dostarczenia krwi do laboratorium [18].

Preparatyka komórek macierzystych do celów transplantacyjnych na przykładzie Publicznego Banku Komórek Macierzystych w Podzamczu Chęcińskim

Publiczny Bank Komórek Macierzystych w ramach swojej działalności stosuje dwie metody preparatyki krwi pępowinowej − automatyczną i manualną. W pierwszej wymienionej metodzie jest wykorzystywany w pełni zautomatyzowany system zamknięty do preparatyki krwi pępowinowej − Sepax^®. Specjalnie dedykowane do aparatu zestawy zapewniają bezpieczeństwo i prawidłowy rozdział krwi, izolując do osobnego pojemnika maksymalną liczbę komórek macierzystych, redukując jednocześnie liczbę erytrocytów oraz objętość osocza. Otrzymywany jest preparat komórek o objętości ok. 20 ml. Elementem linii technologicznej jest aparat Smart-Max stosowany do przygotowania preparatu komórek macierzystych do krioprezerwacji. Za pomocą powyższej aparatury, w kontrolowanym tempie oraz w stałej temperaturze, dodawany jest dimetylosulfotlenek (DMSO), który pełni funkcję krioprotektanta podczas procesu mrożenia materiału. Metoda automatyczna preparatyki krwi jest stosowana na całym świecie i pozwala na zminimalizowanie czynników ryzyka związanych z systemem otwartym.
Metoda manualna jest standardową i długotrwałą (w porównaniu z metodą automatyczną) techniką otrzymywania preparatu komórek macierzystych z krwi pępowinowej. W tym celu jest redukowana objętość materiału za pomocą sedymentacji z zastosowaniem 6-proc. roztworu hydroksyetylowanej skrobi (HES). Rozdzielanie składników krwi (osocze, kożuszek leukocytarny, erytrocyty) następuje z wykorzystaniem pras sedymentacyjnych z dokładnością zależną od wizualnej oceny pracownika odpowiedzialnego za procedurę oraz wirowania w wirówce dedykowanej do worków z krwią. Krioprotektant jest dodawany do preparatu również manualnie, w kontrolowanych przez pracownika warunkach (czas i temperatura).

W celu bieżącej kontroli materiału, w trakcie preparatyki wykonywana jest analiza materiału przed procesem zagęszczenia materiału na standardowym analizatorze hematologicznym 5-dif i po nim. Kluczowym parametrem jest liczba leukocytów, w której jest zawarta subpopulacja komórek macierzystych. Dodatkowo po zagęszczeniu oraz analizie morfologicznej jest wykonywane oznaczenie żywotności i liczebności komórek macierzystych na cytometrze przepływowym. Podczas analizy dokonuje się równoczesnej oceny populacji żywych, podwójnie dodatnich CD45⁺/CD34⁺ hematopoetycznych komórek macierzystych, zarówno w ilości postaci bezwzględnej CD34⁺ (komórki/µl), jak i w postaci odsetkowej całkowitej liczby żywych leukocytów CD34⁺ (%CD34⁺). Materiał może stanowić świeża bądź rozmrożona krew pępowinowa.

Niezależnie od stosowanej metody preparatyki, materiał biologiczny jest kontrolowany pod kątem zakażeń mikrobiologicznych. Po zakończonej preparatyce posiew pozostałości materiału po preparatyce krwi jest wykonywany do dwóch butelek hodowlanych, gdzie jedna zawiera podłoże dla bakterii tlenowych, a druga dla bakterii beztlenowych. Inkubacja butelek zachodzi w inkubatorze mikrobiologicznym, który jest przeznaczony do szybkiego wykrywania bakterii z krwi i innych płynów ustrojowych. Inkubacja zachodzi w stałej temperaturze (ok. 35°C). W przypadku gdy drobnoustroje są obecne, metabolizują składniki odżywcze zawarte w podłożu hodowlanym, uwalniając do podłoża dwutlenek węgla, co wpływa na ilość światła absorbowanego przez materiał fluorescencyjny. Obecność drobnoustrojów w próbce jest natychmiast sygnalizowana przez aparat. W przypadku otrzymania pozytywnego wyniku jest możliwość szybkiej identyfikacji drobnoustrojów na aparacie BD Phoenix. Aparat identyfikuje, w warunkach stałej temperatury, zarówno większość bakterii tlenowych i względnie beztlenowych Gram-dodatnich, jak i większość bakterii tlenowych i względnie beztlenowych Gram-ujemnych.

Prawidłowo oznakowany i przygotowany preparat komórek macierzystych z krwi pępowinowej po procesie preparatyki poddaje się procedurze gradientowego zamrażania w dedykowanej do tego zamrażarce w parach ciekłego azotu. Stopniowe zamrażanie do temperatury -90°C materiału w kontrolowanych warunkach zapewnia wysoką przeżywalność komórek, a tym samym dobrą jakość preparatu. Wstępnie zamrożone jednostki umieszczane są w zbiornikach kriogenicznych i przechowywane (w stałej temperaturze ok. -196°C) w parach ciekłego azotu do momentu znalezienia zgodnego biorcy.

Podsumowanie

Powstawanie publicznych banków komórek macierzystych stwarza możliwości dokonywania większej liczby przeszczepów allogenicznych od dawcy niespokrewnionego oraz daje szansę na istotny postęp naukowy w dziedzinie badań nad krwią pępowinową, która stanowi bardzo obiecującą alternatywę terapeutyczną w leczeniu wielu chorób, w tym chorób dziecięcych [12, 16].

Regionalne Centrum Naukowo-Technologiczne

Piśmiennictwo

1. Bielec B., Stojko R.: Komórki macierzyste krwi pępowinowej – zastosowanie terapeutyczne. „Postępy Hig Med Dosw”, 2015, 69, 853-863.

2. Dhot C., Sirohi M.D., Swamy B.: Collection, Separation, Enumeration and Cryopreservation of Umbilical Cord Blood Haematopoietic Stem Cells − An Experimental Study. „MJAFI”, 2003, 59, 298-301.

3. Rubistein P. i wsp.: Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution. „Proc. Nati. Acad. Sci.”, 1995, 92, 10119-10122.

4. Stolarek M., Myśliwski A.: Komórki macierzyste krwi pępowinowej. „Postępy Biologii Komórki”, 2005, 32 (2), 375-390.

5. Armson B.A., Allan D.A., Casper R.F.: Umbilical Cord Blood: Counselling, Collection, and Banking. „J Obstet Gynaecol Can”, 2015, 37 (9), 832-844.

6. Sasidharan M. i wsp.: Stem Cell Transplantation: Umbilical Cord. „International Journal of Pharma Research & Review”, 2015, 4 (3), 15-21.

7. Merlin G., Butler J., Menitove E.: Umbilical cord blood banking: an update. „J Assist Reprod Genet”, 2011, 28, 669-676.

8. Peberdy L., Young J., Kearney L.: Health care professionals knowledge, attitudes and practices relating to umbilical cord blood banking and donation: an integrative review. „BMC Pregnancy and Childbirth”, 2016, 16, 81.

9. Ballen K.K., Gluckman E., Broxmeyer H.E.: Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. „Blood”, 2013, 122, 491-498.

10. Stojko R. i wsp.: Wpływ pH i pCO₂ krwi pępowinowej uzyskiwanej okołoporodowo na wybrane parametry komórek macierzystych. „Ginekol Pol”, 2014, 85, 582-588.

11. Hamblin R.: Stem Cell Banking – The Growth of Public and Private Cord Blood Banks. „Stem Cells, Regenerative medicine and Society”, 2010, 4-6.

12. Reboredo N.M. i wsp.: Collection, processing and cryopreservation of umbilical cord blood for unrelated transplantation. „Bone Marrow Transplantation”, 2000, 26, 1263-1270.

13. Kozłowska-Skrzypczak M., Kmarnicki M.: Hematopoetyczne komórki macierzyste i krwiotworzenie. „Diagnostyka laboratoryjna”, 2008, 44, 231-239.

14. Ali H., Al-Mulla F.: Defining umbilical cord blood stem cells. „Stem Cell Discovery”, 2012, 2, 15-23.

15. Kenneth J., Moise J.: Umbilical Cord Stem Cells. „Obstetrics and Gynecology”, 2005, 106, 6.

16. Petrini C.: Umbilical cord blood banking: from personal donation to international public registries to global bioeconomy. „J Blood Med.”, 2014, 5, 87-97.

17. Pawelec K., Bonk I., Boruczkowski D.: Możliwości zastosowania komórek macierzystych w leczeniu cukrzycy typu 1. „Borgis − Nowa Pediatria”, 2013, 1, 30, 34.

18. Dharmasaroja P.: Bone marrow-derived mesenchymal stem cells for the treatment of ischemic stroke. „J Clin Neurosci”, 2009, 16 (1), 12-20.

19. Arno A. i wsp.: Human Wharton’s jelly mesenchymal stem cells promote skin wound healing through paracrine signaling. „Stem Cell Research & Therapy”, 2014, 5, 28.

20. Aguyao-Mazzucato C., Bonner-Weir S.: Stem cell therapy from type 1 diabetes mellitus. „Nat. Rev. Endocrinol.”, 2010, 6, 139-148.

21. Machaj E. i wsp.: Pozyskiwanie, preparatyka i zamrażanie krwi pępowinowej dla celów klinicznych. „Acta Haematologica Polonica”, 2001, 32, 3.

fot. Istock