Diagnostyka zespołu antyfosfolipidowego w świetle aktualnych zaleceń
Rozpoznanie APS opiera się w dużej mierze na pracy diagnosty laboratoryjnego. Ważne jest zatem zachowanie szczególnej staranności w pobraniu i przygotowaniu materiału do badania, a także zapewnienie takich metod badawczych, które w świetle aktualnej wiedzy będą stanowiły pełną i optymalną diagnostykę zespołu antyfosfolipidowego.
Zespół antyfosfolipidowy (ang. antiphospholipid syndrome, APS) to niezapalna choroba układowa, której obraz kliniczny związany jest przede wszystkim z występowaniem zakrzepicy tętniczej, żylnej i drobnych naczyń, która jest przyczyną całego wachlarza objawów ze strony wielu układów i narządów, spośród których szczególną uwagę zwraca się na niepowodzenia położnicze. Objawom towarzyszy występowanie w osoczu chorego przeciwciał antyfosfolipidowych (ang. antiphospholipid antibodies, APAs, aPAs), które mają swój istotny udział w rozwoju powikłań zakrzepowych. Wyróżnia się pierwotny i wtórny APS. Pierwotna postać to taka, której nie towarzyszy żadna inna choroba autoimmunizacyjna; o wtórnym APS mówi się natomiast wtedy, kiedy towarzyszy on innej chorobie układowej, np. toczniowi układowemu rumieniowatemu (ang. systemic lupus erythematosus, SLE). W ostatnich latach znacznie wzrosła świadomość zagrożenia, które niesie ze sobą APS. Z tego względu, wychodząc naprzeciw potrzebom chorych oraz lekarzy, wiele laboratoriów zdecydowało się wprowadzić do swojej oferty badania w kierunku obecności przeciwciał antyfosfolipidowych. Warto zatem usystematyzować wiedzę na temat roli diagnostyki laboratoryjnej w rozpoznawaniu zespołu antyfosfolipidowego.
Pierwsze wzmianki o obecności czynnika, który wydłużał czasy krzepnięcia zależne od fosfolipidów, a który dziś nazywamy antykoagulantem tocznia (ang. lupus anticoagulant, LA), pochodzą z początku lat 50. XX w. [8]. Opisano wtedy przypadek chorego na toczeń układowy, u którego wystąpiła skaza krwotoczna, a w jego osoczu wykryto czynnik, który powodował wydłużenie czasów krzepnięcia zależnych od fosfolipidów. Kilkanaście lat wcześniej wprowadzono do diagnostyki kiły odczyn VDRL (ang. Veneral Diseases Laboratory Research), w którym do wykrywania reaginy kiłowej wykorzystywano kardiolipinę zawartą w wyciągu z serca wołowego. Zauważono, że wyniki fałszywie dodatnie odczynu VDRL pojawiają się szczególnie często u osób chorych na toczeń układowy. W następnych latach pojawiały się doniesienia o krążących w osoczu antykoagulantach, które nie tylko nie powodowały krwawień, ale były związane ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy oraz poronień [5, 16]. Z tego względu wykrywanemu czynnikowi nadano nazwę antykoagulantu tocznia, którą to stosuje się do dziś. Zależne od obecności LA występowanie zakrzepicy oraz niepowodzeń położniczych nazwano zespołem antyfosfolipidowym.
W celu rozpoznania APS stosuje się kryteria z Sydney z 2006 r. opublikowane w „Journal of Thrombosis and Haemostasis” [18]. Wyróżniono w nich kryteria kliniczne i laboratoryjne. Uznano, że do rozpoznania APS wystarczy spełnienie przynajmniej jednego kryterium klinicznego i przynajmniej jednego laboratoryjnego. Do kryteriów klinicznych zaliczono:
• zakrzepicę żylną, tętniczą lub drobnych naczyń – zakrzepica musi zostać potwierdzona obiektywnymi metodami (metody obrazowe);
• niepowodzenia położnicze:
– zgon prawidłowego morfologicznie płodu, którego nie da się wyjaśnić innymi przyczynami, który nastąpił w co najmniej 10. tygodniu ciąży;
– urodzenie prawidłowego morfologicznie dziecka przed 34. tygodniem ciąży, które spowodowane było: rzucawką, stanem przedrzucawkowym lub niewydolnością łożyska, stwierdzonymi zgodnie z obowiązującymi wytycznymi;
– trzy lub więcej następujących po sobie kolejno spontanicznych poronień przed 10. tygodniem ciąży, których nie daje się wyjaśnić innymi przyczynami, po wykluczeniu wad anatomicznych i zaburzeń hormonalnych u matki, a także aberracji chromosomalnych u matki i ojca.
Kryteria laboratoryjne obejmują:
• stwierdzenie co najmniej dwukrotnie w odstępie co najmniej 12 tygodni w osoczu chorego obecności antykoagulantu tocznia metodami opisanymi w wytycznych Internal Society of Thrombosis and Haemostasis z 1995 r. z późniejszymi aktualizacjami [6, 21];
• stwierdzenie co najmniej dwukrotnie w odstępie co najmniej 12 tygodni w osoczu lub surowicy, za pomocą wystandaryzowanego testu ELISA, obecności przeciwciał przeciw kardiolipinie (ang. anticardiolipin antibodies, aCL) w klasie G i/lub M w mianie średnim lub wysokim – czyli w mianie powyżej 40 jednostek GPL dla klasy IgG i powyżej 40 jednostek MPL dla klasy IgM, lub w mianie powyżej 99. percentyla dla obydwu klas przeciwciał;
• stwierdzenie co najmniej dwukrotnie w odstępie co najmniej 12 tygodni w osoczu lub surowicy chorego przeciwciał przeciwko beta2-glikoproteinie I (ang. β2-glycoprotein I, β2GPI) za pomocą wystandaryzowanego testu ELISA, w klasie IgG i/lub IgM w mianie powyżej 99. percentyla.
Na podstawie wyników badań laboratoryjnych w cytowanych kryteriach wyróżniono dwie główne kategorie i trzy podkategorie laboratoryjne APS:
I u chorego obecny jest więcej niż jeden typ przeciwciał antyfosfolipidowych;
II u chorego obecny jest tylko jeden typ przeciwciała antyfosfolipidowego:
a. obecny tylko antykoagulant tocznia;
b. obecne tylko przeciwciała antykardiolipinowe;
c. obecne tylko przeciwciała przeciwko β2-glikoproteinie I.
Przeciwciała antyfosfolipidowe – heterogenną grupą przeciwciał
Określenie „antyfosfolipidowe” sugeruje, że przeciwciała te skierowane są przeciwko fosfolipidom. W rzeczywistości ich antygenami są najczęściej różnorodne białka związane z fosfolipidami (m.in.: β2-glikoproteina I, protrombina, białko C, białko S, czynnik V, aneksyna II, aneksyna V, czynnik VII). Do tej pory opisano ponad dwadzieścia różnych przeciwciał z tej grupy, z których tylko trzy zostały ujęte w kryteriach z Sydney: antykoagulant tocznia, przeciwciała przeciw kardiolipinie i β2-glikoproteinie I.
Wszystkie trzy typy przeciwciał uwzględnionych w kryteriach z 2006 r. mogą być skierowane przeciwko epitopom na cząsteczce β2GPI, co często rodzi trudności w zrozumieniu różnic pomiędzy nimi, a stosowana nomenklatura bywa myląca. Cząsteczka β2-glikoproteiny I jest zawartym w osoczu polipeptydem złożonym z jednego łańcucha o masie 50 kDa. Łańcuch ten składa się z 326 aminokwasów. W jego obrębie wyróżnia się pięć domen ponumerowanych od I do V, zaczynając od N-końca łańcucha polipeptydowego. Domeny od I do IV są zbudowane z podobnych sekwencji złożonych z 60 aminokwasów, C-końcowa domena V zaś zbudowana jest z 82 aminokwasów i zawiera trzy mostki dwusiarczkowe. Domena V odpowiedzialna jest za wiązanie β2-glikoproteiny I z ujemnie naładowanymi fosfolipidami (m.in. kardiolipiną, fosfatydyloseryną), z heparyną, z błoną komórkową zaktywowanych płytek krwi oraz komórek śródbłonka, z komórkami apoptotycznymi, a także z mikrocząstkami pochodzącymi z błon komórkowych płytek i leukocytów. W osoczu β2-glikoproteina I krąży w formie zwiniętej. Wynika to z faktu, iż fragment domeny V łączy się z fragmentem domeny I. W ten sposób epitopy domeny I są niejako ukryte przed układem immunologicznym. Aby β2-glikoproteina I mogła przyłączyć się do fosfolipidów, musi nastąpić otwarcie cząsteczki i odsłonięcie epitopów antygenowych domeny I. Zidentyfikowano autoprzeciwciała przeciwko wszystkim pięciu domenom, jednak wydaje się, iż najważniejszą rolę w APS odgrywają przeciwciała przeciwko domenie I, a ich występowanie wiąże się z wyższym ryzykiem wystąpienia zakrzepicy.
Antykoagulant tocznia zawdzięcza swą nazwę dwóm zaobserwowanym zjawiskom. Zauważono, że w osoczu niektórych chorych, szczególnie często zaś chorych na toczeń rumieniowaty układowy, znajduje się przeciwciało hamujące reakcje krzepnięcia zależne od fosfolipidów, co prowadzi do wydłużenia zależnych od fosfolipidów czasów krzepnięcia osocza, lecz nie przekłada się na zwiększoną częstość lub nawet ryzyko krwawień. Ponieważ wydłużeniu pod wpływem tego przeciwciała ulegały czasy zależne od fosfolipidów, a dodanie ich nadmiaru skutkowało częściowym lub całkowitym zneutralizowaniem jego działania, wysunięto przypuszczenie, że skierowane jest ono właśnie przeciwko fosfolipidom. Obecnie wiadomo, iż antygenem dla antykoagulantu tocznia są białka związane z fosfolipidami: protrombina i β2-glikoproteina I [26]. Pod pojęciem „antykoagulant tocznia” nie należy zatem rozumieć konkretnego przeciwciała skierowanego do ściśle określonego antygenu, ale takie przeciwciała o różnej swoistości, które in vitro mają zdolność wydłużania reakcji zależnych od fosfolipidów, in vivo zaś nie powodują skazy krwotocznej ani nie zwiększają ryzyka jej wystąpienia; wręcz przeciwnie, mogą sprzyjać wystąpieniu zakrzepicy. Do ich wykrywania stosuje się w laboratorium metody krzepnięciowe oparte na czasach krzepnięcia osocza zależnych od fosfolipidów.
Kardiolipina jest ujemnie naładowanym fosfolipidom. Używana jest jako składowa antygenów w teście VDRL. Ponieważ wśród chorych z APS obserwowano wysoki odsetek fałszywie dodatnich wyników odczynu VDRL, wysunięto przypuszczenie, że kardiolipina jest jednym z antygenów dla przeciwciał antyfosfolipidowych. Istnieją przeciwciała, dla których antygenem jest sama kardiolipina, jednak w kontekście zespołu antyfosfolipidowego określenie „przeciwciała antykardiolipinowe” oznacza takie przeciwciała, które rozpoznają różne epitopy na cząsteczce β2-glikoproteiny I połączonej z cząsteczką kardiolipiny (a nie samą kardiolipinę). Tak rozumiane przeciwciała antykardiolipinowe w toku diagnostyki APS wykrywa się za pomocą testu ELISA, w którym jako antygenu używa się kardiolipiny połączonej z β2-glikoproteiną I. W kryteriach diagnostycznych APS z 2006 roku zaleca się oznaczanie przeciwciał antykardiolipinowych w klasie IgG i IgM, natomiast nie w klasie IgA. Wynik testu wyraża się w jednostkach GPL dla przeciwciał klasy IgG, a także MPL dla klasy IgM. Stworzono także testy ELISA, w których stosuje się jako antygen samą β2-glikoproteinę I bez łączenia jej z kardiolipiną. Wykryte za ich pomocą przeciwciała określa się mianem przeciwciał przeciw β2-glikoproteinie I, bez wyszczególnienia, przeciwko której domenie cząsteczki β2GPI są skierowane. Uważa się, że są to testy bardziej swoiste dla β2-glikoproteiny I, nie mogą być jednak stosowane zamiennie z testami do wykrywania przeciwciał antykardiolipinowych.
Przeciwciała niezawarte w kryteriach diagnostycznych APS
Poza włączonymi do kryteriów z Sydney, kolejne przeciwciała antyfosfolipidowe, nieujęte w tych kryteriach, zyskują na znaczeniu. Wykazano, że występowanie przeciwciał skierowanych przeciwko określonym sekwencjom aminokwasowym domeny I cząsteczki β2-glikoproteiny I w klasie IgG jest związane ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy i powikłań położniczych [9, 15]. Postuluje się także, iż przeciwciała te są bardziej swoiste dla APS niż przeciwciała przeciwko innym domenom β2-glikoproteiny I. W celu ich wykrywania stosuje się odpowiednie testy oparte o technikę ELISA, chemiluminescencji lub metody radioimmunologiczne (and. radio immuno assay, RIA).
Uwagę badaczy zwracają przeciwciała skierowane przeciwko kompleksowi protrombina/fosfatydyloseryna. Udowodniono, iż ich występowanie w klasie IgG i/lub IgM jest wysoce swoiste dla APS i wiąże się ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia zakrzepicy żylnej i tętniczej oraz powikłań położniczych. Ocenia się, że przeciwciała te mogą być użyteczne w diagnozowaniu APS u chorych, u których wykonanie badań w kierunku antykoagulantu tocznia jest trudne, ponieważ ich występowanie silnie koreluje z występowaniem antykoagulantu tocznia. Dodatkowo przeciwciała przeciwko kompleksowi protrombina/fosfatydyloseryna uważa się obecnie za bardziej swoiste dla APS niż odrębne przeciwciała przeciwko protrombinie i przeciwciała przeciwko fosfatydyloserynie [1, 3, 4]. Przeciwciała przeciwko kompleksowi protrombina/fosfatydyloseryna i przeciwko protrombinie rozpoznają inne epitopy, nie są zatem takimi samymi przeciwciałami. Skierowane przeciwko protrombinie przeciwciała określano jako czynnik ryzyka nawracających epizodów zakrzepowych oraz czynnik ryzyka powikłań zakrzepowych u chorych na toczeń rumieniowaty.
Objawy kliniczne APS
Rozpoznanie zespołu antyfosfolipidowego opiera się na objawach klinicznych i badaniach laboratoryjnych. Spośród objawów klinicznych w kryteriach diagnostycznych APS uwzględniono zakrzepicę tętniczą, żylną i drobnych naczyń, oraz określone niepowodzenia położnicze. Spektrum objawów klinicznych APS jest jednak o wiele szersze i obejmuje wiele układów i narządów. Większość z tych objawów spowodowana jest zakrzepicą naczyń i niedokrwieniem tkanek, inne zaś (np. różne postaci kłębuszkowego zapalenia nerek) – dysfunkcją układu immunologicznego, tworzeniem i odkładaniem kompleksów immunologicznych, a także aktywacją układu dopełniacza (tab. 1).
Według kryteriów z Sydney rozpoznanie APS, oprócz wystąpienia przynajmniej jednego objawu klinicznego, wymaga wykrycia odpowiednimi metodami w odstępie co najmniej dwunastotygodniowym przynajmniej jednego spośród trzech rodzajów przeciwciał: antykoagulantu tocznia, przeciwciał antykardiolipinowych lub przeciwko β2-glikoproteinie I. Uważa się, że wykonywanie badań w kierunku obecności tych przeciwciał u osób bez objawów klinicznych nie jest postępowaniem właściwym. W 1995 r. opublikowano zalecenia Komitetu do spraw Zespołu Antyfosfolipidowego przy ISTH (ang. Internal Society of Thrombosis and Hemostasis), w których podzielono zasadność wykonywania badań laboratoryjnych w kierunku APS na trzy grupy [6]:
1. niska zasadność – badania wykonywane u starszych chorych ze stwierdzoną zakrzepicą żylną lub tętniczą;
2. umiarkowana zasadność – badania wykonywane u osób bez objawów APS, u których stwierdzono izolowane wydłużenie czasów zależnych od fosfolipidów (np. APTT); badania kobiet, u których dochodzi do częstego poronienia na bardzo wczesnym etapie ciąży; chorzy, u których doszło do zakrzepicy, a u których znany jest inny niż APS czynnik wywołujący zakrzepicę;
3. wysoka zasadność – badania u chorych, u których wystąpiła niesprowokowana innymi czynnikami zakrzepica, chorzy przed 50. rokiem życia, u których doszło do zakrzepicy tętniczej, chorzy z zakrzepicą o nietypowej lokalizacji, kobiety, u których dochodzi do poronienia w późniejszym etapie ciąży, chorzy na choroby autoimmunizacyjne, u których rozwija się zakrzepica lub dochodzi do utraty ciąży na każdym jej etapie.
Wykrywanie antykoagulantu tocznia
Strategia wykrywania antykoagulantu tocznia ma trzy etapy:
1. uzyskanie wydłużonego wyniku czasu zależnego od fosfolipidów (np. APTT);
2. wykonanie testu korekcji w celu wykazania obecności inhibitora przy jednoczesnym wykluczeniu niedoboru czynnika/czynników krzepnięcia krwi;
3. wykazanie, że inhibitor jest zależny od fosfolipidów.
Antykoagulant tocznia nie jest jednym rodzajem przeciwciała skierowanym przeciwko ściśle określonemu antygenowi. Mianem tym określa się każde przeciwciało skierowane przeciwko białkom związanym z fosfolipidami (często przeciwko protrombinie, β2-glikoproteinie I), które będzie powodowało wydłużenie zależnych od fosfolipidów czasów krzepnięcia osocza. Dlatego te właśnie czasy stosuje się do wykrywania i potwierdzania jego zależnej od fosfolipidów natury. Niestety zmienna natura przeciwciał zaliczanych do grupy antykoagulantu tocznia, a także różnorodne składy odczynników, związana z tym różna wrażliwość poszczególnych metod na obecność antykoagulantu powodują, że w laboratoriach często uzyskuje się wyniki niejednoznaczne, a pomiędzy laboratoriami – wyniki czasami skrajnie odmienne. Z tego względu w 2009 r. opublikowane zostały uaktualnienia zaleceń dotyczących wykrywania antykoagulantu tocznia [21]. W aktualizacji autorzy zalecają, aby krew do badania pobrana była przed rozpoczęciem leczenia przeciwzakrzepowego. Krew powinna być pobrana na cytrynian sodowy o stężeniu 109M, w stosunku 9:1 (9 części krwi do 1 części cytrynianu). Zaleca się dwukrotne odwirowanie próbki w celu uzyskania osocza ubogopłytkowego (poniżej 10^4 płytek krwi na 1 µl osocza). Usunięcie jak największej ilości płytek krwi z osocza jest istotne, ponieważ fosfolipidy pochodzące z ich błon komórkowych mogą fałszować wyniki testu (wynik fałszywie ujemny). Jeśli laboratorium nie może wykonać badania bezpośrednio po pobraniu krwi, zaleca się jak najszybsze zamrożenie osocza, najlepiej w temperaturze poniżej -70°C, a jego rozmrażanie – w temperaturze 37°C w ciągu pięciu minut w łaźni wodnej, tak aby uniknąć wytrącenia krioprecypitatu. W celu wykazania, że wydłużenie zależnego od fosfolipidów czasu krzepnięcia osocza spowodowane jest obecnością inhibitora, należy wykonać test korekcji. W tym celu autorzy zalecają użycie ubogopłytkowego osocza pacjenta oraz handlowego lub przygotowanego w laboratorium osocza normalnego. Laboratorium powinno upewnić się, że aktywność czynników krzepnięcia krwi w osoczu normalnym przygotowanym na miejscu wynosi około 100%. Antykoagulant tocznia jest inhibitorem niezależnym od czasu, procedura testu korekcji powinna więc uwzględnić inkubację w temperaturze 37°C w celu różnicowania z inhibitorem czynnika VIII. Test korekcji powinien być wykonany wtedy, gdy oznaczony czas APTT jest dłuższy o co najmniej 10 s od górnej wartości referencyjnej. W podstawowej wersji testu korekcji wykonuje się mieszaninę osocza badanego i osocza normalnego w stosunku objętości 1:1. W przypadku gdy antykoagulant tocznia występuje w osoczu badanym w niskim mianie, na skutek rozcieńczenia, w mieszaninie, możliwe jest uzyskanie skróconego czasu APTT, co spowoduje wyciągnięcie błędnego wniosku, że brak jest antykoagulantu tocznia. Sytuacji tej można zaradzić, stosując mieszaninę o proporcjach 4 części osocza badanego do 1 części osocza prawidłowego. Ważne jest, aby dla tak przygotowanej mieszaniny zastosować odpowiednie kryteria interpretacyjne. W przypadkach wątpliwych, kiedy trudno jest jednoznacznie określić, czy doszło do korekcji, można posłużyć się odpowiednimi wzorami:
1. indeks Rosnera [23]: 
Wartość indeksu poniżej 12% oznacza korekcję (niedobór czynnika/czynników), powyżej zaś 15% brak korekcji, czyli obecność inhibitora. Wartości pomiędzy 12-15% są niejednoznaczne.
2. Metoda porównania dwóch wartości [17]: wartość równania: (APTT osocza badanego – APTT mieszaniny) porównuje się do wartości równania: 
Jeśli wartość pierwsza jest większa od tej drugiej – zaszła korekcja, stwierdzono niedobór czynnika/czynników, jeśli zaś wartość pierwsza jest mniejsza od drugiej, stwierdza się brak korekcji i obecny inhibitor.
3. Wzór Changa do wyliczenia procentu korekcji [7]:
Do interpretacji dobiera się odpowiednie kryteria, w zależności od proporcji, w jakich sporządzona została mieszanina:
a. Dla mieszaniny w proporcji 1:1 – wartość powyżej 70% oznacza korekcję, poniżej zaś 58% brak korekcji. Wartości pomiędzy 58-70% są niejednoznaczne;
b. Dla nieinkubowanej mieszaniny w proporcji 4:1 za wartość graniczną przyjęto 50%. Współczynnik powyżej 50% oznacza korekcję, poniżej tej wartości zaś – brak korekcji;
c. Dla inkubowanej w 37°C mieszaniny w proporcji 4:1 wartość współczynnika powyżej 10% oznacza korekcję, poniżej zaś – jej brak.
Należy pamiętać o bardzo rzadko występującym efekcie lupus cofactor. Polega on na paradoksalnym wydłużeniu czasu APTT w mieszaninie zawierającego antykoagulant tocznia osocza badanego i osocza normalnego tak, że czas APTT mieszaniny jest dłuższy niż czas APTT osocza badanego. Zjawisko to można tłumaczyć tym, że w przypadku niektórych przeciwciał zaliczanych do antykoagulantu tocznia dostarczenie wraz z osoczem prawidłowym kofaktora, którym może być np. protrombina lub β2-glikoproteina I, powoduje znaczne wzmocnienie siły działania antykoagulantu i związane z tym znaczne wydłużenie APTT [27].
Po wykonaniu testu korekcji i stwierdzeniu obecności inhibitora należy wykazać, że jest on zależny od fosfolipidów. W tym celu zaleca się wykonanie czasu z rozcieńczonym jadem żmii Russella (ang. diluted Russell Viper venom time, dRVVT) oraz APTT z krzemianami jako aktywatorem. Nie zaleca się stosowania do oznaczenia APTT odczynników z kaolinem lub kwasem elagowym jako aktywatorami, gdyż mogą one wykazywać mniejszą czułość na antykoagulant tocznia. Autorzy zaleceń podkreślają, że optymalnym postępowaniem jest wykonanie tych dwóch testów (dRVVT i APTT). Ograniczenie się tylko do jednego może prowadzić do fałszywych wyników, ponieważ żaden z nich nie jest wrażliwy na wszystkie typy antykoagulantu tocznia [21]. Test z użyciem rozcieńczonego jadu żmii Russella służy do wykazania zależnej od fosfolipidów natury wykrytego inhibitora. Jad żmii Russella bezpośrednio aktywuje czynnik X, który następnie tworzy wraz z: czynnikiem Va, jonami wapnia i fosfolipidami, kompleks protrombinazy aktywujący protrombinę do trombiny. Ze względu na udział fosfolipidów w kompleksie protrombinazy czas dRVVT jest czasem zależnym od fosfolipidów i wrażliwym na obecność antykoagulantu tocznia. Aby sprawdzić, czy wykryty w teście korekcji inhibitor ma zależną od fosfolipidów naturę, należy oznaczyć w osoczu badanym oraz osoczu normalnym czas dRVVT w środowisku niewielkiego stężenia fosfolipidów oraz w środowisku ich znacznego nadmiaru. Uzyskanie wydłużonego czasu w teście z niewielką zawartością fosfolipidów i jego skrócenie w teście z ich nadmiarem jest dowodem na zależną od fosfolipidów naturę inhibitora. Porównania czasów nie dokonuje się wprost, bazując na surowych wartościach czasu dRVVT uzyskanych w osoczu badanym. W celu normalizacji z wartości czasów dRVVT osocza badanego i normalnego wylicza się odpowiednie współczynniki, które wykorzystuje się do ostatecznej interpretacji testu [13]. Producent zestawu odczynnikowego powinien dostarczyć zwalidowane przez siebie kryteria interpretacyjne wyliczanych współczynników.
Pożądaną sytuacją jest wykonywanie badań w kierunku obecności antykoagulantu tocznia u chorego, u którego nie stosuje się żadnego leczenia przeciwzakrzepowego, oraz u którego nie toczy się aktywny proces zakrzepowy. W codziennej praktyce diagności laboratoryjni są jednak czasem proszeni o wykonywanie badania u chorego, u którego właśnie stwierdzono zakrzepicę i/lub który otrzymuje heparynę lub doustne leki przeciwzakrzepowe. W takich sytuacjach, jeśli odłożenie w czasie diagnostyki nie jest możliwe, należy zachować szczególną ostrożność przy interpretacji wyników. Należy pamiętać, że w czasie aktywnego procesu zakrzepowego aktywność czynnika VIII może wzrastać do bardzo wysokich wartości, co może z kolei znacząco wpływać na czas APTT. W przypadku pacjentów leczonych antagonistami witaminy K zaleca się odłożenie badań w kierunku antykoagulantu tocznia do czasu co najmniej jednego – dwóch tygodni po zakończeniu ich stosowania, do czasu normalizacji współczynnika INR. Jeśli jest to niemożliwe, autorzy zaleceń [21] sugerują, aby wykonać badanie w osoczu, w którym wartość INR jest mniejsza niż 1,5. Jeśli INR mieści się w granicach 1,5-3,0, autorzy dopuszczają możliwość wstępnego rozcieńczenia osocza badanego osoczem normalnym w stosunku 1:1 i wykonywania dalszych procedur w tak sporządzonej mieszaninie. Niesie to jednak ryzyko uzyskania fałszywie ujemnych wyników u tych chorych, u których antykoagulant tocznia jest obecny w niskim mianie. Istnieje także możliwość wykonania testów u chorych, u których terapia antagonistami witaminy K jest zastąpiona stosowaniem heparyn drobnocząsteczkowych. Pobranie krwi do badań powinno wtedy nastąpić po znormalizowaniu współczynnika INR i co najmniej dwunastu godzinach po ostatnim podaniu heparyny drobnocząsteczkowej. Obecnie nie zaleca się także stosowania u tych chorych czasu ekarynowego i tekstarynowego do wykrywania antykoagulantu tocznia. Stosowanie u pacjenta terapii heparyną niefrakcjonowaną w zasadzie uniemożliwia prawidłową interpretację badań w kierunku antykoagulantu tocznia. Mimo że przytaczane zalecenia dopuszczają wykonywanie badań u chorych leczonych przeciwzakrzepowo, należy wyraźnie podkreślić, że optymalnym postępowaniem jest odroczenie diagnostyki do momentu ustąpienia procesu zakrzepowego i zakończenia terapii przeciwzakrzepowej, kiedy układ hemostazy powróci do właściwej dla danego chorego równowagi.
„Potrójna i podwójna pozytywność”
Przeciwciała wyróżnione w kryteriach z 2006 r. są różnorodną grupą przeciwciał, a obecność poszczególnych z nich wiąże się z różnym ryzykiem wywołania epizodów zakrzepowych i niepowodzeń położniczych. Z tego względu konieczne było określenie, która konfiguracja przeciwciał wiąże się z największym ryzykiem wystąpienia wspomnianych powikłań. Na podstawie badań stworzono termin tzw. „trójpozytywności” i „podwójnej pozytywności”, które oznaczają chorych, u których występuje określony układ przeciwciał antyfosfolipidowych związany z największym ryzykiem wystąpienia zakrzepicy i/lub poronienia. O trójpozytywności mówi się, gdy u chorego stwierdzono obecność antykoagulantu tocznia oraz przeciwciał antykardiolipinowych w klasie IgG lub IgM, a także przeciwciał przeciwko β2-glikoproteinie I w klasie IgG lub IgM. Podwójna pozytywność to sytuacja, w której antykoagulantowi tocznia towarzyszą przeciwciała antykardiolipinowe w klasie IgG lub przeciwciała przeciw β2-glikoproteinie I w klasie IgG [19, 20, 25].
Katastrofalny APS
„Potrójna pozytywność” wiąże się ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia tzw. katastrofalnego zespołu antyfosfolipidowego (ang. catastrophic antiphospholipid syndrome, CAPS). Jest to bardzo rzadko występująca postać kliniczna APS o poważnym rokowaniu i śmiertelności sięgającej około 30%, w której dochodzi do szybkiego uszkodzenia narządów wewnętrznych i rozwoju niewydolności wielonarządowej. Katastrofalny APS rozwija się najczęściej u chorych, u których już wcześniej zdiagnozowano zespół antyfosfolipidowy, a u których wystąpił dodatkowo czynnik wyzwalający nasiloną uogólnioną reakcję (zabieg operacyjny, infekcja). W przebiegu CAPS dochodzi do rozsianej zakrzepicy, zwłaszcza naczyń jamy brzusznej, nerek oraz płuc, układu nerwowego i (rzadziej) serca, i towarzyszącej jej układowej odpowiedzi (ang. systemic inflammatory response syndrome, SIRS). W 2003 r. opracowano kryteria diagnostyczne CAPS [2], w których wyróżniono cztery kryteria (dwa kliniczne, jedno histopatologiczne i jedno laboratoryjne):
1. zajęcie trzech lub więcej narządów/układów i lub tkanek;
2. objawy rozwijają się jednocześnie lub w ciągu tygodnia;
3. badania histopatologiczne – potwierdzone histopatologicznie zamknięcie przez zakrzepy drobnych naczyń w co najmniej jednym narządzie lub tkance, którym mogą towarzyszyć zmiany charakterystyczne dla zapalenia naczyń;
4. dodatni wynik badań w kierunku antykoagulantu tocznia i/lub przeciwciał antykardiolipinowych, potwierdzonych ponownym badaniem po dwunastu tygodniach, jeśli chory miał zdiagnozowany APS wcześniej. W przypadku gdy CAPS jest pierwszą manifestacją zespołu antyfosfolipidowego, spełnienie tego kryterium jest niemożliwe.
Jeśli u chorego spełnione są wszystkie cztery kryteria, rozpoznanie CAPS jest pewne. W przypadku gdy:
• spełnione są wszystkie cztery kryteria, jednak zmiany dotyczą jedynie dwóch narządów, układów lub tkanek;
• spełnione są wszystkie cztery kryteria, jednak nie było możliwe potwierdzenie obecności przeciwciał antyfosfolipidowych po co najmniej 6 tygodniach w ponownych testach z powodu śmierci pacjenta, który nie był wcześniej diagnozowany w kierunku APS;
• spełnione są kryteria: 1., 2. i 4.;
• spełnione są kryteria: 1., 3. i 4.;
rozpoznaje się tzw. prawdopodobny (możliwy) katastrofalny zespół antyfosfolipidowy.
Seronegatywny zespół antyfosfolipidowy
Kryteria rozpoznawania APS z Sydney 2006 r. jasno wskazują, że do rozpoznania zespołu antyfosfolipidowego konieczne są wystąpienie przynajmniej jednego objawu klinicznego i utrzymująca się obecność przynajmniej jednego spośród trzech typów przeciwciał. Obserwuje się jednak pacjentów, u których występują objawy kliniczne bardzo charakterystyczne dla APS, a u których jednak nie udaje się wykazać obecności przeciwciał uwzględnionych w kryteriach. Zaproponowano zatem utworzenie kategorii tzw. seronegatywnego zespołu antyfosfolipidowego (ang. seronegative antiphospholipid syndrome, SN-APS) [12]. Należy pamiętać, że kryteria rozpoznawania APS z 2006 r. nie uwzględniają wszystkich znanych dziś przeciwciał antyfosfolipidowych. Część chorych, u których testy w kierunku przeciwciał antykardiolipinowych i przeciwko β2-glikoproteinie I w klasie IgG i IgM wychodzą ujemne, może wytwarzać te przeciwciała w klasie IgA [11]. U części pacjentów, u których nie udaje się wykryć przeciwciał zawartych w kryteriach z 2006 r., obecne są inne przeciwciała, np.: przeciwko fosfatydyloserynie, kwasowi fosfatydowemu lub fosfatydyloinozytolowi [14]. Możliwe jest także zjawisko tzw. przejściowej seronegatywności spowodowane stosowaniem kortykosteroidów lub innych leków immunosupresyjnych [24]. U chorych, u których APS towarzyszy innym chorobom układowym, m.in. toczniowi rumieniowatemu, w którego przebiegu może rozwinąć się zespół nerczycowy, przejściowa seronegatywność może być spowodowana utratą przeciwciał z moczem [22]. Opisano także przypadki wystąpienia przejściowej seronegatywności u chorych z masywną zakrzepicą, u których doszło niejako do zużycia przeciwciał antyfosfolipidowych w trakcie toczącego się procesu zakrzepowego [10]. W każdym przypadku, gdy objawy kliniczne silnie wskazują na zespół antyfosfolipidowy, a badania laboratoryjne w kierunku przeciwciał wskazanych w kryteriach z Sydney wychodzą ujemnie, przed wdrożeniem dodatkowych badań w kierunku przeciwciał nieujętych w kryteriach diagnosta laboratoryjny powinien upewnić się, że materiał do badań, w szczególności w kierunku antykoagulantu tocznia, został pobrany i przygotowany w sposób prawidłowy. Jak już wspomniano wyżej, badanie to powinno być przeprowadzone w osoczu ubogopłytkowym, gdyż nadmiar płytek krwi zawierających w swych błonach fosfolipidy może prowadzić do uzyskania wyników fałszywie ujemnych. Warto też pamiętać o możliwych fałszywie ujemnych wynikach u chorych, u których antykoagulant tocznia występuje w niskim mianie. U takich chorych można wykonać testy korekcji z użyciem mieszaniny w proporcji 4:1, z zastosowaniem odpowiednich kryteriów interpretacyjnych.
Podsumowanie
Zespół antyfosfolipidowy wciąż stanowi wyzwanie dla lekarzy klinicystów i współpracujących z nimi diagnostów laboratoryjnych. Wiedza na temat tego poważnego w swych konsekwencjach zespołu jest coraz bardziej powszechna, a badania laboratoryjne użyteczne w jego rozpoznawaniu są dostępne w coraz większej liczbie laboratoriów. Rozpoznanie APS opiera się w dużej mierze na pracy diagnosty laboratoryjnego. Ważne jest zatem zachowanie szczególnej staranności w pobraniu i przygotowaniu materiału do badania, a także zapewnienie takich metod badawczych, które w świetle aktualnej wiedzy będą stanowiły pełną i optymalną diagnostykę zespołu antyfosfolipidowego.
