fot. Istock

TITLE: Diagnostics based on serology tests in SARS-CoV-2 infections

STRESZCZENIE: Badania serologiczne w wykrywaniu aktywnej choroby COVID-19 nie mają dużego znaczenia. Jednak przy wzrastającej liczbie chorych bezobjawowo, którzy nie są diagnozowani, jest to jedyna możliwość retrospektywnej oceny tego zjawiska oraz wnioskowania o odporności stadnej. Aktualnie prowadzone niezależne walidacje pozwalają wskazać najbardziej wiarygodne testy laboratoryjne i do wykorzystania w miejscu opieki.

SŁOWA KLUCZOWE: COVID-19, immunoglobuliny, przeciwciała, szybkie testy

SUMMARY: Serological tests are not useful in diag­nosing active COVID-19 disease. However, with the increasing number of asymptomatic patients who are not recognized, this is the only way to retrospectively evaluate this phenomenon and to infer about herd immunity. Currently conducted independent validations allow to indicate the most reliable laboratory as well as POCT tests.

KEYWORDS: COVID-19, immunoglobulin, antibody, rapid tests

Epidemia spowodowana przez wirusa SARS-CoV-2 (pierwotnie 2019-nCoV) wywołującego chorobę COVID-19, przez okres zaledwie trzech miesięcy od rozpoznania pierwszego przypadku osiągnęła określony przez WHO poziom pandemii [1]. Metodami referencyjnymi i zalecanymi w diagnostyce rutynowej tej choroby są badania molekularne. W tej dziedzinie nastąpił ogromny postęp, skrócił się czas uzyskania wyniku do kilkudziesięciu minut, w niektórych metodach nawet do kilkunastu minut. Przy powszechnym wykonywaniu i wykorzystywaniu analizatorów do badań molekularnych w kierunku innych infekcji wpłynie to korzystnie na cenę oznaczeń. Można przypuszczać, że w najbliższej przyszłości nastąpi zmiana jakościowa diagnostyki laboratoryjnej (jak i przyłóżkowej) chorób infekcyjnych z badań serologicznych na badania molekularne.

Liczne polskie, jak i światowe wytyczne stanowią, że badania serologiczne nie powinny być podstawą rozpoznania COVID-19 [2]. Przeciwciała w przebiegu tej choroby pojawiają się stosunkowo późno, choć brak jednoznacznych danych, kiedy dokładnie. Wg amerykańskiej Centers for Disease Control and Prevention (CDC) przeciwciała anty SARS CoV-2 można u niektórych pacjentów wykryć już w pierwszym tygodniu od początku objawów klinicznych, ale zwykle wykrywalne miano występuje w 2.-3. tygodniu od zakażenia, a IgM i IgG narastają prawie równocześnie [3]. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny (NIZP-PZH) podaje na swojej stronie, że wykrycie diagnostycznego poziomu swoistych przeciwciał anty-SARS-CoV-2 klasy IgM jest możliwe najwcześniej po około 10 dniach od momentu wystąpienia pierwszych objawów klinicznych zakażenia, natomiast przeciwciał klasy IgG jeszcze później W próbkach pobranych w 8.-14. dniu od początku choroby przeciwciała klasy IgM i IgG wykrywano odpowiednio u 73,5% i 54,1% chorych [4]. Wg badań Longa i wsp. opublikowanych w końcu kwietnia bieżącego roku w „Nature” przeciwciała klasy IgG pojawiają się u wszystkich pacjentów po 17-19 dniach od pierwszych objawów klinicznych, a przeciwciała klasy IgM nawet trochę później − po 20-22 dniach [5]. Pewną nadzieję na szybszą diagnostykę wiąże się z przeciwciałami klasy IgA, które (być może) można wykryć parę dni wcześniej we krwi, jak i w ślinie lub wymazie z gardła.

Na drugim biegunie znajdują się eksperci, w większości epidemiolodzy, którzy zalecają powszechne wykonywanie testów serologicznych oraz ich powtarzanie u osób, które nie wytworzyły jeszcze przeciwciał [6]. Odpowiedzią na taką strategię walki z epidemią jest ogromna podaż testów laboratoryjnych i do badań w miejscu opieki (POCT) służących do wykrywania przeciwciał anty SARS-CoV-2 w różnych klasach i w różnych konfiguracjach. Wg strony internetowej Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND), powiązanej z WHO jako Centrum wspierania laboratoriów i oceny technologii diagnostycznych (WHO Collaborating Centre for Laboratory Strengthening and Diagnostic Technology Evaluation), aktualnie dostępnych jest ponad 330 testów serologicznych w kierunku COVID-19, z czego 285 wykrywa przeciwciała. 66 z nich jest dedykowanych tylko do badań naukowych, a kolejne 44 są w trakcie procedur certyfikacyjnych. Pozostałe testy posiadają różne certyfikaty. Europejski certyfikat dopuszczający do badań in vitro (CE IVD) uzyskało 214 testów, natomiast dopuszczenie Amerykańskiej Agencji Żywności i Leków (FDA) posiada tylko 9 testów, i to tylko jako Emergency Use Authorization (EUA) [7].

Liczba testów, które uzyskały CE IVD, w porównaniu do dopuszczenia przez FDA, świadczy, że waga tego pierwszego certyfikatu nie jest duża. Wytwórcy uzyskują go na podstawie oświadczenia, że dany produkt spełnia wymagania przewidziane dla niego w stosownych dyrektywach i przepisach wewnętrznych, oraz że spełnienie tych wymagań zostało potwierdzone w toku przeprowadzonych procedur oceny zgodności. W Polsce nie obowiązuje wymóg stosowania przez laboratoria diagnostyczne sprzętu albo odczynników posiadających certyfikat CE IVD ani tym bardziej FDA, choć oczywiście lepiej korzystać z testów posiadających przynajmniej certyfikat europejski.
Być może liczne doniesienia o niskiej jakości szybkich testów serologicznych z Włoch, Hiszpanii, Wielkiej Brytanii, Słowacji, Polski i innych krajów wynikają ze zbyt pochopnej certyfikacji. O ile producenci deklarują przeciętnie czułość testów dla IgG rzędu 92-100%, a dla IgM 65-95% i swoistość dla obu tych klas powyżej 96%, to niezależne badania, przede wszystkim szybkich testów immunochromatograficznych, wskazują na duży odsetek (35-45%) wyników fałszywie ujemnych i ok. 7% fałszywie dodatnich. O ile za część wyników fałszywie ujemnych można winić pomiary w materiałach pobranych w zbyt wczesnej fazie choroby (okienko serologiczne) i zbyt niską czułość testu, to wyniki fałszywie dodatnie mogą być wynikiem reakcji krzyżowych. Producenci żadnego z 20 z analizowanych przez autorów tego opracowania szybkich testów w kierunku przeciwciał anty SARS-CoV-2 nie badali reaktywności krzyżowej z przeciwciałami przeciwko innym koronawirusom. Przeciwciała takie (przez analogię zakłada się, że podobnie będzie w COVID-19) utrzymują się w mierzalnym mianie od kilku miesięcy do kilku lat po łagodnych infekcjach wywołanych przez inne koronawirusy (HCoV-OC43 czy HCoV-HKU1). Należy tu dodać, że wyniki fałszywie ujemne czy fałszywie dodatnie nie dotyczą jedynie testów serologicznych w diagnostyce COVID-19. Wiadomo, że wynik ujemny badania molekularnego, tj. brak stwierdzenia obecności materiału genetycznego SARS-CoV-2, nie wyklucza możliwości zakażenia, podobnie u 11% objawowe zakażenie SARS-CoV-2 przebiega bez charakterystycznych zmian radiologicznych w płucach, o przypadkach bez- czy skąpo-objawowych nie wspominając, które są nie do wykrycia w badaniu fizykalnym i większości badań dodatkowych [8].

Różne organizacje państwowe (Europejskie Centrum Prewencji i Kontroli Chorób (ECDC); FDA i CDC, NIH (National Institute of Health)) i niezależne (FIND) są w trakcie niezależnej walidacji testów serologicznych. Pierwsze raporty są już dostępne w sieci (np. https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situations-medical-devices/eua-authorized-serology-test-performance czy https://www.finddx.org/covid-19/sarscov2-eval-immuno/) i zgodnie z oczekiwaniami wskazują na wysoką jakość badanych testów laboratoryjnych i niższą kasetkowych testów POCT.

Jeśli badania serologiczne w kierunku SARS-CoV-2 nie nadają się do wykrywania aktywnej choroby, to jak takie testy można wykorzystać?

Protokół WHO z marca 2020 r. zaleca określenie skali przechorowań w populacji ogólnej przy pomocy testów immunofluorescencyjnych lub immunoenzymatycznych (ELISA) wykrywających obecność przeciwciał [9]. Również w Polsce coraz więcej autorytetów podnosi konieczność uruchomienia systemowego badania przeciwciał przeciw SARS-CoV-2.

Badania takie są jedyną możliwością retrospektywnego wykrycia osób, które przechorowały COVID-19 bezobjawowo lub skąpoobjawowo i nie zostały zidentyfikowane badaniami molekularnymi. Badania można, a właściwie należy zastosować do oceny odsetka uodpornionych, co pozwoli na określenie skali odporności populacyjnej (stadnej) oraz pozwoli wnioskować o odsetku osób w danej populacji, które bezobjawowo przechorowały COVID-19. Biorąc pod uwagę znaczącą liczbę bezobjawowych przechorowań, badania serologiczne mogą służyć do oceny zasięgu rozprzestrzeniania się choroby. Takie wiarygodne dane pozwalają na tworzenie globalnych i lokalnych strategii walki z epidemią. W ściśle wytypowanych populacjach (pracownicy ochrony zdrowia czy pracownicy, którzy w ramach wykonywanej pracy przebywają blisko siebie) ocena immunokompetencji pozwala na takie kohortowanie, które minimalizuje ryzyko zachorowania wśród osób podatnych. Nie bez znaczenia są oczekiwania społeczne. Wiele osób, na podstawie doniesień medialnych o znaczącym odsetku bezobjawowych przypadków COVID-19, nie jest pewna, czy nie przechorowała COVID-19 bezobjawowo i chciałoby się przebadać w trosce o siebie, członków swojej rodziny, współpracowników czy znajomych. Brak pewności, czy dana osoba przechorowała COVID-19, czy nie, często urasta do rangi dużego problemu, stąd też są znaczne oczekiwania społeczne na refundowane wykonywanie takiej retrospektywnej diagnostyki. Dodatkowo szybkie testy można by wykorzystać do taniego monitorowania/wykrywania bezobjawowych pacjentów w kwarantannie, szczególnie przy medialnie nagłośnionych przypadkach znacznych opóźnień w badaniach molekularnych u takich osób. Osobom przebywającym na kwarantannie można by dostarczyć kasetkowe testy immunochromatograficzne wraz z instrukcją wykonania. Takie testy powinny być wykonane w cyklach co 7 dni (0, 7., 14., 21. doba kwarantanny), przy kontakcie (nadzorze) zdalnym przy użyciu nowych technologii, np. wideopołączeń z lekarzem lub diagnostą laboratoryjnym. Po wykonaniu badania pacjent powinien zrobić zdjęcie wykonanego oznaczenia (kasetki), przesłać je do lekarza/diagnosty, który zdalnie dokonałby interpretacji. Zdjęcie powinno być archiwizowane w dokumentacji medycznej pacjenta. Biorąc pod uwagę wspomnianą powyżej możliwość wyników fałszywie dodatnich, w badaniach osób kwarantannowanych największą wartość informatywną ma stwierdzenie serokonwersji IgM i IgG w jednym z kolejnych badań po badaniu w czasie 0 lub najpierw serokonwersja w klasie IgM, przy niewielkim opóźnieniu w ujawnieniu się przeciwciał klasy IgG. Należy jednak podkreślić, że żaden test kasetkowy w diagnostyce zakażenia SARS-CoV-2 nie został dopuszczony do samodzielnego wykonania. FDA dopuściło do użytku jedynie dwa testy, w których pacjent może samodzielnie pobrać materiał (wymaz z gardła i ślina), który jest analizowany w wyspecjalizowanym laboratorium [10]. I na koniec trzeba też wskazać, że wiarygodne badania przeciwciał są niezbędne przy testowaniu szczepionek.

Jednak przy wdrażaniu badań populacyjnych należy wziąć pod uwagę nie tylko wiarygodność testów, ale też użyteczność wyników takich badań i szacunkową liczbę chorych/ozdrowieńców w badanej kohorcie. WHO w kwietniu poinformowało, że nie ma dowodów, że ozdrowieńcy z COVID-19, jeśli w ogóle mają przeciwciała, są chronieni przed powtórną infekcją. Ponadto wg WHO z badań wynika, że zainfekowanych jest/było do 3% populacji poszczególnych krajów, a liczba osób po serokonwersji jest mniejsza, niż oczekiwano [11]. Szczególnie niepokojąca jest ta ostatnia informacja. Mniejsza niż oczekiwana liczba osób po serokonwersji może wynikać z:

1. Niewiarygodnych testów, ale ten problem zostanie wkrótce rozwiązany, poprzez niezależną walidację.
2. Testowania zanim u pacjentów dojdzie do serokonwersji (w czasie okienka serologicznego) – dlatego badania populacyjne powinny być powtarzane, przynajmniej wśród osób, które nie mają oznaczalnego miana przeciwciał przeciw SARS-CoV-2. Natomiast powtórne oznaczanie wśród osób, które wytworzyły przeciwciała, pozwoliłoby na ustalenie, jak długo utrzymuje się odporność.
3. Niektórzy chorzy nie wykształcają przeciwciał, choć wg cytowanych powyżej badań Longa i wsp. wszyscy pacjenci, z różnym opóźnieniem, wykształcają przeciwciała IgG i IgM [5].
4. Mniejszej liczby osób chorujących bezobjawowo, niż wskazują na to wstępne badania.

Pomijając aspekt psychologiczny, bez wątpienia ważny dla wielu osób, niezależnie od uzyskanego wyniku, wykonywanie badań epidemiologicznych ma sens przy odpowiedniej liczbie chorych w populacji. Nie bez znaczenia są koszty takich badań, ale istotna dla wnioskowania jest też częstość występowania choroby w populacji.
Przy swoistości diagnostycznej 99% (tego rzędu swoistość stwierdzono w walidacji przeprowadzonej przez FDA dla serologicznych testów laboratoryjnych), jeśli choroba występuje w populacji z częstością 1/100 (1%) to statystycznie przy 100 przebadanych osobach uzyskamy (zakładając też prawie 100-proc. czułość diagnostyczną) 2 wyniki dodatnie − jeden prawdziwie dodatni, a drugi fałszywie dodatni. Przy swoistości diagnostycznej 96%, wg FDA typowej dla testu kasetkowego i tej samej częstości choroby przy wykonanych 100 testach 5 wyników będzie dodatnich, z tego tylko 1 prawdziwie dodatni. Dlatego przy niskiej częstości choroby w badanej populacji wnioskowanie na podstawie wyników powszechnie wykonywanych badań laboratoryjnych może być obarczone dużym błędem. Liczba osób chorych objawowo w Polsce nie jest duża, dlatego krytyczna do podjęcia decyzji o serologicznych badaniach populacyjnych może być orientacyjna liczba osób, które chorują bezobjawowo. Obecnie dostępne doniesienia z badań epidemiologicznych na temat odsetka osób chorujących bezobjawowo niestety nie są (podobnie jak czas od infekcji do wytworzenia przeciwciał) spójne. W zamkniętych populacjach – pasażerów i załóg kwarantannowanych statków, jak Diamond Princess czy ostatnio Greg Mortimer, liczba przypadków bezobjawowego przebiegu choroby przekraczała 50% − Diamond Princess – 58,9%, przy czym ponad połowa z tych osób prezentowała zmiany radiologiczne w płucach; z kolei na pokładzie Grega Mortimera aż w 81% przypadków stwierdzono obecność wirusa przy braku objawów klinicznych [12, 13]. Podobne dane – do 88% przypadków bezobjawowych stwierdzono w różnych regionach Stanów Zjednoczonych. Niestety badania prowadzone w Europie prezentują całkowicie odmienne wyniki. Według seropozytywnych pracowników belgijskiej służby zdrowia 90% z nich miało objawy COVID-19, z kolei z badań niemieckich wynika, że tylko 22% osób zakażonych SARS-CoV-2 choruje bezobjawowo [14].

Podsumowując, w badaniach epidemiologicznych COVID-19 niezbędne są populacyjne badania serologiczne, które są zdecydowanie tańsze od badań molekularnych i w odróżnieniu od tych ostatnich umożliwiają ocenę retrospektywną zachorowań oraz ocenę odporności stadnej przy dużym odsetku niezdiagnozowanych osób chorujących bezobjawowo. Wiarygodna analiza wyników takich badań zależy od czułości i swoistości użytych testów oraz częstości choroby w populacji.

Piśmiennictwo

1. https://www.who.int/dg/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19—-11-march-2020.

2. Zhou F., Yu T., Du R. et al.: Clinical course and risk factors for mortality of adult inpatients with COVID-19 in Wuhan, China: a retrospective cohort study. „The Lancet”, 2020.

3. https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/resources/antibody-tests-guidelines.html.

4. Rastawicki W., Rokosz-Chudziak N.: Characteristics and assessment of the usefulnessof serological tests in the diagnostic of infections caused by coronavirus SARS-CoV-2 on the basis of available manufacturer’s data and literature review. „Przegl Epidemiol”, 2020, 74 (1), 113-132.

5. Long Q.X., Liu B.Z., Deng H.J. i wsp.: Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients with COVID-19. „Nat Med.”, 2020, Apr 29.

6. Adams E.R., Ainsworth M., Anand R. i wsp.: Antibody testing for COVID-19: A report from the National COVID Scientific Advisory Panel. „BMJ Yale”, 2020.

7. https://www.finddx.org/covid-19/pipeline/.

8. WHO Interim guidance 19 March 2020.

9. https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation-reports/20200319-sitrep-59-covid-19.pdf?sfvrsn=c3dcdef9_2.

10. https://www.labcorp.com/coronavirus-disease-covid-19/patient-information/covid-19-testing-options.

11. WHO statement 24.04.2020.

12. Ing A., Cocks C., Green J.P.: COVID-19: In the footsteps of Ernest Shackleton. „Thorax”, 2020, May 27.

13. Yamahata Y., Shibata A.: Preparation for quarantine on the cruise ship Diamond Princess in Japan due to COVID-19. „JMIR Public Health Surveill.”, 2020, May 11.

14. Streeck H., Schulte B., Kümmerer B.M. i wsp.: Infection fatality rate of SARS-CoV-2 infection in a German community with a super-spreading event. „BMJ Yale”, 2020.

fot. Istock