Biobezpieczeństwo w laboratorium mikrobiologicznym
Do najważniejszych środków bezpieczeństwa należą właściwie zaplanowane pomieszczenia, stosowanie odpowiednich zabezpieczeń, chroniących przed wydostaniem się w sposób niekontrolowany materiału biologicznego, i przestrzeganie zasad dobrej praktyki mikrobiologicznej.
Praca w laboratorium mikrobiologicznym polega na pobraniu materiału, wyizolowaniu i identyfikacji drobnoustrojów lub wykluczeniu ich obecności w badanej próbce. Materiałami do badań, w zależności od rodzaju laboratorium mikrobiologicznego, mogą być: próbka diagnostyczna pochodząca od pacjenta, surowce do wytwarzania, półprodukty i gotowe produkty lecznicze, kosmetyki, środki spożywcze oraz próbki środowiskowe. Tak więc pracownicy laboratorium w sposób zamierzony lub niezamierzony są narażeni na kontakt z szerokim spektrum czynników biologicznych, będących potencjalnym źródłem zakażenia.
W laboratorium ograniczenie ryzyka związanego z pracą z czynnikami biologicznymi, polega na zapobieganiu wystąpienia zakażenia. Należy także zapewnić stałą ochronę pracownika i środowiska przed narażeniem na kontakt z czynnikami zakaźnymi obecnymi w badanych materiałach.
Na bezpieczeństwo pracy w laboratorium mają wpływ:
• właściwie zaplanowane pomieszczenia, wyposażone w prawidłowo funkcjonującą aparaturę i sprzęt;
• odpowiednie kwalifikacje personelu oraz świadomość istnienia potencjalnych zagrożeń;
• właściwe użytkowanie środków ochrony osobistej, takich jak: fartuch, rękawiczki, okulary ochronne;
• przestrzeganie zasad bezpiecznej pracy z mikroorganizmami.
Wybór odpowiednich środków bezpieczeństwa wymaga określenia stopnia ryzyka związanego z pracą z czynnikami biologicznymi. Można tego dokonać na podstawie analizy rodzaju i właściwości materiału biologicznego, z jakim styka się pracownik w laboratorium.
Czynniki biologiczne
Czynniki biologiczne w dyrektywie unijnej i polskim prawie są definiowane jako drobnoustroje komórkowe, w tym zmodyfikowane genetycznie jednostki bezkomórkowe zdolne do replikacji lub przenoszenia materiału genetycznego (w tym zmodyfikowane genetycznie), hodowle komórkowe, pasożyty wewnętrzne człowieka mogące być przyczyną zakażenia, alergii lub zatrucia [1, 2].
Stopień narażenia na czynniki biologiczne zależy od: wirulencji drobnoustrojów, stopnia ciężkości choroby, którą mogą wywołać, zdolności przetrwania w środowisku, dawki infekcyjnej, dróg przenoszenia oraz sytuacji epidemiologicznej w kraju. Może również zależeć od indywidualnych reakcji pracownika oraz od dostępności do profilaktyki i leczenia [3].
Nie można ustalić bezpiecznego poziomu narażenia, jak również dopuszczalnych wartości narażenia zawodowego, tj. poziomu, poniżej którego nie obserwuje się występowania negatywnych skutków zdrowotnych. Dzieje się tak ze względu na specyfikę działania czynników biologicznych, tj. zmienność drobnoustrojów, oraz brak stałej zależności pomiędzy ich liczebnością, czasem kontaktu a odpowiedzią organizmu [4].
Ocena ryzyka i biobezpieczeństwo
Ryzyko w laboratorium mikrobiologicznym jest ściśle związane z bioryzykiem, czyli prawdopodobieństwem wystąpienia niekorzystnego wydarzenia, które w konsekwencji może doprowadzić do uwolnienia i przeniknięcia mikroorganizmów do otoczenia (w sposób przypadkowy lub celowy), a następnie spowodować zakażenie pracowników.
Ocena bioryzyka jest przeprowadzana poprzez analizę ryzyka wystąpienia przypadkowego zakażenia oraz analizę ryzyka bezpieczeństwa biologicznego związanego z dostępem do materiału biologicznego osób nieupoważnionych, jak również jego utratą, kradzieżą lub nadużyciem.
Dla prawidłowego przeprowadzenia oceny ryzyka narażenia na czynniki biologiczne istotna jest identyfikacja drobnoustrojów w oparciu o: stopień zjadliwości, drogę przenoszenia (pośrednia czy bezpośrednia), łatwość szerzenia się zakażenia, możliwość zapobiegania i leczenia oraz liczbę drobnoustrojów niezbędną do wywołania zakażenia. Tak więc podstawowym kryterium określenia grupy ryzyka czynników biologicznych jest zdolność wywołania chorób zakaźnych, co stanowi kryterium podziału szkodliwych czynników biologicznych na 4 grupy [1, 2] (tab. 1). Klasyfikacja przedstawiona w dokumencie Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) dodatkowo uwzględnia możliwość wywoływania chorób u zwierząt [5].
Różnorodność prowadzonej diagnostyki i badań sprawia, że laboratoria różnią się zarówno liczbą pomieszczeń, jak i rodzajem wyposażenia pomiarowo-badawczego oraz stosowanymi technikami.
W laboratorium, zależnie od poziomu stosowanych zabezpieczeń, możliwa jest praca z czynnikami zakaźnymi należącymi do różnych grup zagrożenia. Wprowadzono cztery poziomy bezpieczeństwa biologicznego laboratorium (Biosafety Level – BSL) od BSL 1 do BSL 4. Podział został zaproponowany przez Centrum Kontroli Zakażeń (Center for Disease Control and Prevention – CDC) w Stanach Zjednoczonych i dotyczy grup ryzyka z poziomem bezpieczeństwa biologicznego (ale nie utożsamia się z nimi).
Poziom bezpieczeństwa biologicznego oparty jest na wymaganiach dotyczących pomieszczeń laboratorium i urządzeń zabezpieczających, wyposażenia, wymaganych praktyk, procedur operacyjnych i badawczych, jakie należy spełnić podczas pracy z drobnoustrojami należącymi do różnych grup ryzyka [5-8].
Zgodnie z polskim prawem [2] materiał badawczy, w którym spodziewamy się wykryć lub w którym podejrzewamy obecność drobnoustrojów należących do różnych grup ryzyka, powinien być badany w laboratorium spełniającym kryteria hermetyczności.
W załączniku 4 rozporządzenia MZ z 22 kwietnia 2005 r. przedstawiono środki i stopnie hermetyczności dla laboratoriów, zwierzętarni, pomieszczeń izolacyjnych dla ludzi i zwierząt, w których odbywa się praca z drobnoustrojami należącymi do różnych grup zagrożenia. W tab. 2 przedstawiono zestawienie grup ryzyka czynników biologicznych, poziomu bezpieczeństwa biologicznego oraz hermetyczności laboratorium.
W laboratorium mikrobiologicznym redukcja ryzyka wystąpienia zakażenia nie ogranicza się jedynie do ochrony pracownika przed narażeniem na kontakt z czynnikami potencjalnie zakaźnymi, obecnymi w badanych próbkach, ale ma także na uwadze ochronę samej próbki i środowiska badań przed kontaminacją.
Laboratoria mikrobiologiczne, w zależności od rodzaju badanych prób, aby zagwarantować wiarygodność uzyskiwanych wyników, muszą spełniać dodatkowe wymagania prawne i normatywne. Określają one zasady działania tych laboratoriów w zakresie dobrej praktyki laboratoryjnej i dotyczą: pomieszczeń, urządzeń laboratoryjnych i sprzętu, szkoleń i zachowań higienicznych personelu, pobierania i postępowania z próbką, jak również dokumentacji.
Pomieszczenia
Istotnym elementem wpływającym na bezpieczeństwo pracy w laboratorium mikrobiologicznym są odpowiednio zaplanowane pomieszczenia i wyposażenie.
W medycznym laboratorium diagnostyki mikrobiologicznej warunki lokalowe i wyposażenie powinno spełniać wymagania określone w Rozporządzeniu z dnia 3 marca 2004 r. w sprawie wymagań, jakim powinno odpowiadać medyczne laboratorium diagnostyczne [9].
Zgodnie z rozporządzeniem pomieszczenia laboratorium powinny być dostosowane do rodzaju prac, jakie są w nich wykonywane. Muszą gwarantować bezpieczne i higieniczne warunki pracy. Laboratorium powinno być wyposażone w aparaturę pomiarowo-badawczą dostosowaną do rodzaju wykonywanych badań i we właściwy sposób nadzorowaną. W medycznym laboratorium rozkład pomieszczeń powinien przebiegać zgodnie z zasadą, że pomieszczenia, w których pracuje się z materiałem zakaźnym, są oddzielone od pozostałych śluzą wyposażoną w umywalkę. Zalecenia w sprawie organizacji i zasad działania laboratoriów diagnostyki mikrobiologicznej zostały opublikowane przez Krajowego Specjalistę w Dziedzinie Mikrobiologii [10].
Wymagania, jakie powinno spełniać laboratorium mikrobiologiczne w firmie farmaceutycznej, są przedstawione w rozporządzeniu Ministra Zdrowia, w części I, w rozdziale 6 [11].
Pomieszczenia laboratorium powinny być wystarczająco duże, aby uniknąć pomyłek i zanieczyszczeń. Ich wielkość powinna być dostosowana do liczby wykonywanych analiz i ogólnej, wewnętrznej organizacji laboratorium. Typowe laboratorium mikrobiologiczne składa się z pomieszczeń badawczych, gdzie wykonuje się określone analizy mikrobiologiczne, oraz pomieszczeń pomocniczych. Dobrą praktyką jest posiadanie odrębnych pomieszczeń do: odbioru, przechowywania, badania próbek w zakresie czystości mikrobiologicznej, badania próbek jałowych. Osobne pomieszczenia powinny być do prowadzenia: inkubacji, przesiewów i badań diagnostycznych, a także przygotowania i sterylizacji pożywek hodowlanych, mycia i przechowywania szkła laboratoryjnego i sprzętu, prowadzenia sterylizacji, odkażania i niszczenia kultur bakteryjnych. Pomieszczenia dodatkowe stanowią: wejścia, korytarze, klatki schodowe, windy towarowe lub osobowe, pomieszczenia administracyjne (biura, archiwa), toalety i szatnie oraz magazyny.
W laboratoriach mikrobiologicznych, w których jest prowadzona kontrola produktów leczniczych, należy zagwarantować warunki badań, które są zgodne z wymaganiami obowiązującymi przy ich wytwarzaniu. Badania leków, dla których jest wymagana jałowość, należy przeprowadzać w klasie czystości powietrza A w otoczeniu klasy czystości powietrza B [12]. Produkty lecznicze, w których kontrolowany jest parametr czystości mikrobiologicznej, zwykle są badane w pomieszczeniach wyposażonych w boksy laminarne lub w szafy laminarne, zwane również komorami bezpiecznej pracy. Dla tych pomieszczeń wymagana jest czystość mikrobiologiczna powietrza, taka jak dla klasy czystości powietrza D lub o znanej i kontrolowanej liczbie zanieczyszczeń mikrobiologicznych. Wytwórca sam określa warunki w jakich wytwarza i bada niejałowe produkty lecznicze. Brak jest jednoznacznie określonych wymagań dla parametru czystości powietrza przy wytwarzaniu leków z dopuszczalnym limitem zanieczyszczeń drobnoustrojami. Należy przyjąć, że warunki wytwarzania i kontroli dla tej grupy produktów leczniczych muszą zapewnić ich jakość zgodną z wymaganiami i dokumentacją dopuszczającą produkt do obrotu.
Laboratoria mikrobiologicznej analizy żywności zazwyczaj są klasyfikowane jako laboratoria, w których należy stworzyć warunki zgodne z wymaganiami dla laboratoriów drugiego stopnia hermetyczności [13]. Zgodnie z normą PN-EN ISO 7218 w laboratoriach mikrobiologicznych analizy żywności należy wydzielić pomieszczenia laboratoryjne lub wyraźnie wyodrębnić obszary przeznaczone do: przyjmowania, przechowywania i przygotowania próbek do badań, wykonywania posiewów, inkubacji, przeprowadzania czynności z drobnoustrojami potencjalnie chorobotwórczymi, przechowywania szczepów, przygotowywania i sterylizacji pożywek oraz sprzętu, przechowywania pożywek i odczynników, odkażania, mycia szkła i innego oprzyrządowania [14].
W laboratorium mikrobiologicznym kontroli jakości kosmetyków najczęściej izolowanymi patogenami z kosmetyków lub surowców stosowanych do ich wytwarzania są: Pseudomononas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Candida albicans, jak również drobnoustroje niespecyficzne, takie jak np.: Burkholderia cepacia, Bacillus sp., Klebsiella sp., Serratia sp., Aspergillus brasilliensis [15]. Są to drobnoustroje, które zgodnie z klasyfikacją zawartą w rozporządzeniu w sprawie szkodliwych czynników biologicznych [2], należą do grupy 2 zagrożenia i powinny być badane w warunkach spełniających standardy laboratorium drugiego stopnia hermetyczności.
Wymagania, jakie należy spełnić w laboratorium mikrobiologicznym kontroli jakości kosmetyków, opisuje polska norma o dobrych praktykach produkcji kosmetyków [16].
Zasadą przy projektowaniu i wykonaniu laboratorium mikrobiologicznego powinno być zachowanie tzw. drogi jednokierunkowej „bez zawracania”, umożliwiającej rozdzielenie wykonywanych czynności w czasie i przestrzeni. Drogi przenoszenia prób przeznaczonych do badania oraz materiałów po badaniu nie powinny się krzyżować z materiałem czystym.
Wyposażenie
Stosowanie dobrej praktyki laboratoryjnej w laboratorium mikrobiologicznym z jednej strony przyczynia się do zabezpieczenia pracownika przed bezpośrednim kontaktem z czynnikiem zakaźnym, z drugiej zaś chroni przed skażeniem stanowiska pracy i kontaminacją badanych próbek.
W laboratorium mikrobiologicznym szczególne zagrożenie może być powodowane przez drobnoustroje znajdujące się w aerozolu, powstającym w trakcie prowadzenia badań. Zaleca się minimalizować uwalnianie aerozoli do pomieszczenia, a wszystkie czynności, mogące je generować, należy wykonywać w komorach bezpiecznej pracy mikrobiologicznej (Microbiology Safety Cabinet – MSC, Biological Safety Cabinets – BSC), zwanych boksami lub szafami laminarnymi [5, 18].
W normie PN-EN 12469:2002 przedstawiono minimalne kryteria działania komór bezpiecznej pracy mikrobiologicznej, których spełnienie zapewnia pełne bezpieczeństwo z uwzględnieniem potencjalnych zagrożeń ze strony mikroorganizmów dla pracowników i środowiska oraz możliwości zakażeń krzyżowych.
W normie opisano metody badań pewności zabezpieczeń, ochrony produktu, zakażeń krzyżowych, wymagania odnośnie do rodzaju materiału, budowy i produkcji komór bezpiecznej pracy mikrobiologicznej. Zawarto również opis metod pomiaru przepływu strumienia powietrza oraz projektowania bezpieczeństwa komór bezpiecznej pracy mikrobiologicznej; rekomendacje dla odkażania, czyszczenia, zadymienia w celu zapewnienia mikrobiologicznego bezpieczeństwa komór laminarnych i filtrów oraz rekomendacje typowych komór bezpiecznej pracy mikrobiologicznej [17].
Norma wyróżnia trzy klasy komór bezpiecznej pracy: MSC typ I, MSC typ II, MSC typ III. W publikacjach WHO rekomendowana jest poszerzona klasyfikacja, w której uwzględniono konstrukcję komory, prędkość i wielkość strumienia przepływającego powietrza oraz jego wywiewu [5].
Komory bezpiecznej pracy I, II, i III klasy zapewniają ochronę pracownika podczas wykonywania procedur z materiałem biologicznym. Komory II klasy zapewniają bezpieczeństwo pracy operatora i równoczesną ochronę badanego materiału przed kontaminacją. Komory III klasy znajdują zastosowanie przy pracy z patogenami należącymi do 4. grupy zagrożenia. W komorze przestrzeń robocza jest całkowicie zamknięta. Miejsce pracy jest oddzielone od operatora barierą fizyczną, np. w postaci rękawic przymocowanych do komory.
Przy wyborze komory bezpiecznej pracy mikrobiologicznej należy uwzględnić rodzaj drobnoustrojów (przynależność do odpowiedniej grupy zagrożenia), jakie występują w badanym materiale lub jakie spodziewamy się wykryć, jak również właściwości badanej próby. W tab. 3 przedstawiono zależność pomiędzy wyborem klasy komory a wymaganą ochroną.
Podsumowanie
Środki bezpieczeństwa w laboratorium mikrobiologicznym powinny być stosowane w celu redukcji lub eliminacji narażenia pracowników laboratorium oraz innych osób i środowiska, na potencjalne czynniki niebezpieczne. Zabezpieczenia należy również stosować, aby chronić próbki i hodowle przed kontaminacją drobnoustrojami środowiskowymi (normalnie obecnymi na rękach, włosach, ubraniu, sprzęcie laboratoryjnym lub w powietrzu), które mogą mieć negatywny wpływ na wyniki badań laboratoryjnych.
Do najważniejszych środków należą właściwie zaplanowane pomieszczenia, stosowanie odpowiednich zabezpieczeń, chroniących przed wydostaniem się w sposób niekontrolowany materiału biologicznego, i przestrzeganie zasad dobrej praktyki mikrobiologicznej.
