fot. Istock

TITLE: Research in the field of transfusion physiology of red blood cells in Poland

STRESZCZENIE: Badania z dziedziny immunologii transfuzjologicznej krwinki czerwonej wykonywane we wszystkich pracowniach podmiotów leczniczych w Polsce podlegają merytorycznemu nadzorowi terenowo odpowiednich centrów krwiodawstwa, które działają w oparciu o ustawę o publicznej służbie krwi i inne akty prawne regulujące ich pracę, i które podlegają nadzorowi merytorycznemu Instytutu Hematologii i Transfuzjologii (IHiT). W systemie tym określone są odpowiednie obowiązki dotyczące audytów, szkoleń, wydawania uprawnień do wykonywania badań z zakresu immunologii transfuzjologicznej, a także działalności konsultacyjnej. Pracownie konsultacyjne centrów krwiodawstwa wykonują specjalistyczne badania w celu ustalenia swoistości przeciwciał u chorych zimmunizowanych, a także badania u pacjentów przed przeszczepami i po nich. Badania konsultacyjne, do przeprowadzenia których konieczne jest dysponowanie zasobem odpowiednich krwinek panelowych oraz surowic w celu identyfikacji przeciwciał do antygenów o wysokiej częstości występowania dla pacjentów z całej Polski, wykonywane są w IHiT. Instytut wykonuje również wysokospecjalistyczne badania genetyczne, w tym badania słabych odmian antygenu D (typ 1, 2 i 3), których nosiciele mogą być traktowani jako RhD dodatni, oraz nieinwazyjne badania antygenów układu Rh (D, C, c, E, G) i Kell u kobiet ciężarnych z przeciwciałami. W przypadku gdy płód nie ma antygenu, do którego skierowane są przeciwciała wykryte u matki, nie ma zagrożenia chorobą hemolityczną płodu/noworodka. Analogiczne badania wykonuje się u kobiet RhD ujemnych bez przeciwciał, by zakwalifikować do podania immunoglobuliny w czasie ciąży tylko kobiety, których płód jest RhD dodatni.

SŁOWA KLUCZOWE: immunologia transfuzjologiczna, choroba hemolityczna płodów i noworodków, krwiodawstwo − organizacja badań

SUMMARY: Research in the field of transfusion physiology of red blood cells performed in all laboratories of medical entities in Poland are subject to substantive supervision of the respective blood donation centres, which operate on the basis of the Act on Public Blood Service and other legal acts regulating their work and which are subject to substantive supervision of the Institute of Haematology and Transfusion Medicine (IHiT). The system specifies the relevant obligations regarding audits, training, issuing permissions to perform transfusion immunology tests as well as consultancy activities. Consultation laboratories of blood donation centers carry out specialised tests for determining the specificity of antibodies in patients with alloimmune/autoimmune sensitisation as well as tests in patients before and after transplants. Consultative tests for which it is necessary to have the resources of appropriate panel blood cells and sera in order to identify antibodies to antigens with a high frequency of occurrence for patients from all over Poland are carried out at IHiT. The Institute also performs highly specialised genetic tests, including tests for weak D-antigen variants (types 1, 2 and 3), whose carriers can be treated as RhD positive, as well as non-invasive tests for Rh antigens (D, C, c, E, G) and Kell in pregnant women with antibodies. If a fetus lacks the antigen to which the antibodies detected in the mother are directed, there is no risk of foetal/neonatal haemolytic disease. Analogous tests are performed in RhD negative women without antibodies to qualify for the administration of immunoglobulin during pregnancy only women whose foetus is RhD positive.

KEYWORDS: transfusion physiology, haemolytic disease of foetuses and newborns, blood donation − organization of tests

Immunohematologia to nauka zajmująca się badaniem odpowiedzi immunologicznej na antygeny komórek i białek krwi, analizą mechanizmów reakcji poprzetoczeniowych oraz chorób wynikających z auto- i alloimmunizacji tymi antygenami. Nauka ta ma istotne zastosowania praktyczne w przetaczaniu krwi i jej składników (transfuzjologia), w przeszczepianiu tkanek i narządów (transplantologia) oraz w położnictwie, gdzie zajmuje się diagnostyką konfliktów serologicznych i wywołanymi przez nie chorobami płodu i noworodka. Istotne jest też znaczenie immunohematologii w diagnostyce i analizie patomechanizmów chorób wywołanych autoprzeciwciałami do komórek krwi.

Tradycyjnie, immunohematologia do lat 70. XX wieku koncentrowała się na badaniach dotyczących krwinek czerwonych, a od lat 60. zajmuje się też zagadnieniami dotyczącymi antygenów obecnych na płytkach i leukocytach. W niniejszym artykule przedstawimy organizację badań z zakresu immunologii transfuzjologicznej, stanowiących podstawę bezpiecznych przetoczeń krwi i diagnostyki choroby hemolitycznej płodów i noworodków (ChHP/N). Skupimy się na wymaganiach dotyczących kwalifikacji personelu i nad systemem nadzoru merytorycznego nad tymi badaniami. Omówimy zakres badań wykonywanych przez laboratoria w podmiotach leczniczych, w laboratoriach referencyjnych centrów krwiodawstwa i Instytutu Hematologii i Transfuzjologii oraz w niektórych laboratoriach specjalistycznych. W artykule tym nie omówimy zagadnień związanych z immunohematologią płytek i leukocytów, które były częściowo poruszone w poprzednich numerach czasopisma [1, 2].

System Służby Krwi i działalność w zakresie immunohematologii w Polsce − zasady prawne, struktura i system nadzoru merytorycznego

Podstawą prawną działania Publicznej Służby Krwi (PSK) jest ustawa o publicznej służbie krwi [3], zgodnie z którą jej działalność koordynuje Minister Zdrowia, a nadzór merytoryczny pełni podległy mu Instytut Hematologii i Transfuzjologii (IHiT). Nadzoruje on między innymi działalność Centrów Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa (CKiK) w zakresie badań z dziedziny immunologii transfuzjologicznej. Nadzorem objęte są Pracownie Immunologii Transfuzjologicznej Centrów Krwiodawstwa, a za ich pośrednictwem pracownie immunologii transfuzjologicznej w podmiotach leczniczych w całym kraju. Schemat organizacyjny przedstawia ryc.1.

Należy podkreślić, że nadzorem jest objęta każda pracownia immunologii transfuzjologicznej działająca w Polsce, bez względu na jej status prawny. Działalność wszystkich Pracowni podlega regulacjom prawnym odnoszącym się do krwiodawstwa i krwiolecznictwa [4, 5], a także przepisom obowiązującym we wszystkich podmiotach wykonujących badania laboratoryjne.

Co dwa lata każda pracownia immunologii transfuzjologicznej w podmiocie leczniczym jest audytowana przez CKiK, a każde CKiK podlega audytowi Instytutu. Dodatkowo Instytut we współpracy z CKiK gromadzi dane o funkcjonowaniu laboratoriów poprzez przeprowadzanie odpowiedniej ankiety [6]. Analizowane są: system zarządzania, liczba i kwalifikacje personelu uprawnionego do wykonywania badań, uczestniczenie pracowni w zewnętrznej ocenie jakości, przeprowadzanie wewnętrznej oceny pracy personelu wykonującego badania z zakresu immunologii transfuzjologicznej, a także metody i techniki badań oraz liczba badań w poszczególnych pracowniach. Zwraca się uwagę na liczbę badań w godzinach pozaregulaminowych i autoryzację ich wyników. Ma to związek z zaleceniem, by w miarę możliwości przetoczenia krwi w oddziałach szpitalnych odbywały się przy pełnej obsadzie personelu medycznego – co ma istotne znaczenie dla bezpieczeństwa biorcy krwi.

W przypadkach nieprawidłowości wykazanych w trakcie audytu CKiK wydaje zalecenia pokontrolne i nadzoruje ich wykonanie. Zalecenia dotyczą np. wprowadzenia uzasadnionych zmian w funkcjonowaniu pracowni, modyfikacji metod badań, dokumentacji, jak również przeprowadzenia dodatkowego szkolenia pracowników w przypadku, gdy przyczyną niepożądanego zdarzenia lub niepożądanej reakcji był błąd pracownika.

Liczba laboratoriów nadzorowanych przez poszczególne CKiK, które objęte są nadzorem i ankietą, jest pokazana na ryc. 2 [6].

Przepisy prawa nakładają na CKiK szereg obowiązków w stosunku do pracowni immunologii transfuzjologicznej działających na ich terenie. CKiK ma obowiązek prowadzenia szkoleń wszystkich pracowników, prowadzenia programów oceny jakości badań w podległych pracowniach, wydaje uprawnienia do wykonywania badań z zakresu immunologii transfuzjologicznej, a także prowadzi dostępną całodobowo działalność konsultacyjną. W Pracowni Konsultacyjnej centrum wykonywane są badania, których nie może wykonać laboratorium szpitala. Zakres badań jest omówiony w kolejnym rozdziale artykułu.

System nadzoru nad działalnością pracowni immunologii transfuzjologicznej zwraca szczególną uwagę na kompetencje i kwalifikacje personelu. Po przyjęciu do pracy przez rok pracownik (technik analityki, diagnosta laboratoryjny lub lekarz) może wykonywać badania jedynie pod nadzorem kierownika lub upoważnionej przez niego osoby. Przed dopuszczeniem do samodzielnego wykonywania badań pracownik odbywa przeszkolenie w CKiK lub w IHiT i po zaliczeniu egzaminu teoretycznego i praktycznego dyrekcja CKiK lub IHiT wydaje mu zaświadczenie uprawniające do samodzielnego wykonywania badań (technicy) lub do samodzielnego wykonywania badań i autoryzowania wyników (lekarze i diagności). W przypadku przerwy w pracy dłuższej niż 2 lata pracownik przed ponownym dopuszczeniem do wykonywania badań odbywa dodatkowe 14-godzinne szkolenie w CKiK lub w IHiT. Istnieją też odpowiednie wymagania dla kierownika pracowni immunologii transfuzjologicznej. Może nim być lekarz lub diagnosta laboratoryjny z co najmniej 2-letnią praktyką w wykonywaniu badań, posiadający zaświadczenie upoważniające do samodzielnego wykonywania badań i autoryzowania ich wyników oraz tytuł specjalisty z klinicznej transfuzjologii medycznej lub z laboratoryjnej transfuzjologii medycznej.

Badania z zakresu immunologii transfuzjologicznej w podmiotach leczniczych

W rozporządzeniu o leczeniu krwią jest określony minimalny zakres badań, które musi wykonywać pracownia immunologii transfuzjologicznej podmiotu leczniczego [5]. Są to: oznaczanie grupy krwi ABO i RhD, wykrywanie przeciwciał odpornościowych w surowicy, wykonywanie prób zgodności. Badania te, choć są badaniami podstawowymi, wymagają od pracownika wnikliwości w ocenie reakcji i właściwej interpretacji wyników. Zauważenie wszelkich odstępstw od prawidłowych reakcji jest konieczne w celu właściwego poprowadzenia dalszych badań zapewniających bezpieczną transfuzję czy prawidłowe rozpoznanie konfliktu serologicznego.

Laboratorium podmiotu leczniczego ma obowiązek wykonania badania przeglądowego na obecność przeciwciał odpornościowych u pacjenta. W przypadku wykrycia alloprzeciwciał, jak również w przypadku stwierdzenia obecności autoprzeciwciał czy też dwóch populacji krwinek, które uniemożliwiają właściwą interpretację wyników badań, laboratorium dalszą diagnostykę przekazuje do Pracowni Konsultacyjnej CKiK, do której kieruje próbki krwi pacjenta wraz z dokumentacją dotychczasowych badań.

Badania immunohematologiczne w pracowniach konsultacyjnych w Centrach Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa oraz Instytucie Hematologii i Transfuzjologii

W CKiK działają przynajmniej dwie pracownie zajmujące się badaniami z dziedziny immunohematologii – jedna to pracownia immunohematologii dawców krwi (to nie będzie przedmiotem obecnej pracy); druga to pracownia konsultacyjna – wykonująca badania immunohematologiczne u pacjentów.

W pracowni konsultacyjnej ustala się swoistość alloprzeciwciał oraz określa fenotypy krwinek czerwonych pacjentów, by na tej podstawie dobierać dla pacjenta krew bez antygenu, do którego wytworzył przeciwciała. Te badania, podobnie jak badania diagnostyczne konfliktu matczyno-płodowego oraz diagnostyka wynikająca z choroby hemolitycznej płodu i noworodka (ChHPiN), wykonywane są na ogół przez pracownie konsultacyjne CKiK lub IHiT.

W CKiK i IHiT wykonywane są badania związane z przeszczepianiem krwiotwórczych komórek macierzystych (KKM), badania u chorych leczonych przeciwciałami monoklonalnymi, np. Daratumumabem (anty-CD38), prowadzona jest diagnostyka niedokrwistości autoimmunohemolitycznych (NAIH) w celu zróżnicowania i scharakteryzowania typu autoprzeciwciał. Określenie typu NAIH (NAIH typu ciepłego, typu zimnego w chorobie zimnych aglutynin, typu mieszanego − z ciepłymi i zimnymi autoprzeciwciałami oraz dwufazowych hemolizyn w napadowej zimnej hemoglobinurii), jest istotne w celu wyboru strategii leczenia chorych. Właściwa charakterystyka autoprzeciwciał oraz wykrycie ewentualnie współwystępujących alloprzeciwciał u tych chorych wymaga zastosowania specjalistycznych procedur.

Wykonywanie badań konsultacyjnych w centrum, a nie we wszystkich podmiotach leczniczych, ma uzasadnienie ekonomiczne, bo do ich prowadzenia konieczne jest dysponowanie szerokim zestawem odczynników monoklonalnych i krwinek wzorcowych, które mają krótki okres ważności. Istotne jest też wdrażanie dodatkowych metod, np. z zastosowaniem rekombinowanych lub syntetycznych peptydów zawierających różne epitopy antygenowe krwinek czerwonych, umożliwiające w skuteczny sposób ustalanie swoistości alloprzeciwciał wykrytych w surowicy pacjenta.

Szczególnym wyzwaniem dla Pracowni Konsultacyjnych CKiK są pacjenci z przeciwciałami do wielu antygenów (przeciwciała wieloswoiste), pacjenci z alloprzeciwciałami do antygenów powszechnie występujących na krwinkach czerwonych w danej populacji, tzw. high-frequency antigens (HFA), a także pacjenci, którzy mieli przetoczenia krwinek czerwonych w okresie trzech miesięcy poprzedzających badanie, a wymagający ustalenia fenotypu. W szeregu przypadków wynik badania można uzyskać tylko przy zastosowaniu metod dostępnych w pracowniach IHiT, a niekiedy w laboratoriach referencyjnych w Europie, najczęściej w Wielkiej Brytanii (Blood Group Reference Laboratory – BGRL w Bristolu).

Badania konsultacyjne z zakresu immunologii transfuzjologicznej w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii

W przypadkach trudności uniemożliwiających wydanie jednoznacznego wyniku określającego grupę krwi czy ustalenie swoistości przeciwciał w pracowni konsultacyjnej CKiK, badania kierowane są do IHiT. Do Zakładu Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej kierowane są próbki od pacjentów i dawców krwi z całej Polski. Badania prowadzone są metodami serologicznymi w Pracowni Immunologii Krwinek Czerwonych oraz metodami biologii molekularnej w Pracowni Genetyki Komórek Krwi. Badania te dotyczą głównie określenia rzadkiej grupy krwi w układzie ABO, słabych odmian antygenu D lub innych antygenów z układu Rh, ustalenia swoistości alloprzeciwciał do antygenu o wysokiej (> 99%) lub niskiej (< 1%) częstości występowania w populacji. Przy identyfikowaniu swoistości tych rzadko występujących przeciwciał pracownia IHiT posługuje się próbkami krwinek o unikalnie rzadkich fenotypach pozyskiwanych z międzynarodowej wymiany próbek między laboratoriami referencyjnymi na całym świecie (SCARF – serum cells and rare fluids exchange). Fenotyp pacjenta jest najczęściej wnioskowany na podstawie badań wykonanych metodą biologii molekularnej. Zakres badań wykonywanych w pracowniach Instytutu, a także zakres stosowanych metod jest analogiczny jak w laboratoriach referencyjnych w innych krajach. Badania, które są wykonywana w Instytucie, podane są w tab. 1. Wyniki niektórych z nich są publikowane [7-11].

Spośród badań konsultacyjnych wykonywanych w ZIHiT IHiT, na szersze rozpropagowanie zasługują trzy grupy badań genetycznych [12-18]. Są to badania służące do identyfikacji biorców niepodatnych na alloimmunizację antygenem D z układu Rh spośród pacjentów, u których występują trudności z określeniem RhD z uwagi na niejednoznaczne wyniki badań serologicznych z powodu bardzo niskiej ekspresji tego antygenu. Osoby te określano dotąd jako RhD ujemne i podawano im krew RhD ujemną, a kobiety z takimi wynikami obejmowano immunoprofilaktyką. Obecnie wiadomo, że około 80% z tych osób, u których słaba ekspresja wynika z obecności allelu D RHD*01W.1, RHD*01W.2; RHD*01W.3, nie jest podatnych na alloimmunizację.

Drugą grupą badań są nieinwazyjne badania genów kodujących antygeny grup krwi płodu. Dzięki nim prowadzi się diagnostykę prenatalną w konfliktach matczyno-płodowych u kobiet z przeciwciałami anty-D (+C), anty-c, anty-E lub anty-G. Badania są dostępne dla ciężarnych z całej Polski. Dzięki nim identyfikuje się kobiety, których płody nie mają antygenu, do którego skierowane są przeciwciała matki, a co za tym idzie, przeciwciała te nie są dla nich groźne.

Nieinwazyjne badania antygenu RhD płodu u kobiet RhD ujemnych wykonuje się też u kobiet bez przeciwciał dla kwalifikacji kobiet do śródciążowego podawania immunoglobuliny anty-D. Immunoglobulinę podaje się tylko kobietom bez przeciwciał, gdy ich płód jest RhD dodatni. Wdrożenie takich badań daje 40% oszczędności w zużyciu immunoglobuliny, która jest produkowana z krwi dawców ochotników szczepionych krwinkami RhD dodatnimi.

Omówiona w tym artykule organizacja badań z dziedziny immunologii krwinki czerwonej oraz wdrażanie nowoczesnych metod sprawia, że częstość poważnych niepożądanych reakcji poprzetoczeniowych w Polsce nie odbiega, a nawet jest niższa od obserwowanej w innych krajach [19]. W dziedzinie badań u ciężarnych dostępność badań serologicznych, a także nowoczesnych badań molekularnych jest analogiczna jak w innych krajach, a ich wykorzystanie zależy od lekarzy ginekologów i położników.

Piśmiennictwo

1. Uhrynowska M., Orzińska A., Guz K. i wsp.: Diagnostyka serologiczna i molekularna chorób płodu i noworodka. „Laboratorium Medyczne”, 2019, 20-27.

2. Łopacz P., Gierszon A., Guz K., Uhrynowska M., Brojer E.: Allo- i autoimmunizacja antygenami leukocytów − konsekwencje kliniczne i diagnostyka prowadzona w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie. „Laboratorium Medyczne”, 2019, 4, 30-36.

3. Ustawa z dnia 22 sierpnia 1997 r. o publicznej służbie krwi (Dz. U. z 2019 r. poz. 1222 z późniejszymi zmianami).

4. Obwieszczenie Ministra Zdrowia z dnia 6 marca 2019 r. w sprawie wymagań dobrej praktyki pobierania krwi i jej składników, badania, preparatyki, przechowywania, wydawania i transportu dla jednostek organizacyjnych publicznej służby krwi.

5. Obwieszczenie Ministra Zdrowia z dnia 18 marca 2020 r. w sprawie wymagań dobrej praktyki przechowywania i wydawania krwi i jej składników dla banków krwi oraz badań z zakresu immunologii transfuzjologicznej wykonywanych w zakładach leczniczych podmiotów leczniczych innych niż regionalne centra, Wojskowe Centrum lub Centrum MSWiA.

6. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 16 października 2017 r. w sprawie leczenia krwią i jej składnikami w podmiotach leczniczych wykonujących działalność leczniczą w rodzaju stacjonarne i całodobowe świadczenia zdrowotne z późniejszymi zmianami z dnia 8 lipca 2019 r.

7. Michalewska B., Bednarz J. i wsp.: Ankieta dotycząca nadzoru CKiK nad laboratoriami immunologii transfuzjologicznej. XXVIII Zjazd PTHiT, Łódź 2019.

8. Michalewska B., Olsson M.L., Naremska G. i wsp.: FUT1 mutations responsible for the H-deficient phenotype in the Polish population, including the first example of an abolished start codon. „Blood Transfus.”, 2018, 16, 101-104.

9. Polin H., Pelc-Klopotowska M., Danzer M. i wsp.: Compound heterozygosity of two novel RHAG alleles leads to a considerable disruption of the Rh complex. „Transfusion”, 2016.

10. Guz K., Orzińska A., Pelc-Kłopotowska M., Krzemienowska M. i wsp.: Identification of blood donors with rare red blood cell phenotypes using low-cost protocols. „Vox Sanguinis”, 2018, 113, 590-263.

11. Pelc-Kłopotowska M., Guz K., Orzińska A. i wsp: Antibodies against high frequency antigen detected in Polish patients between 2000 and 2017. „Vox Sanguinis”, 2018, 113, 484-231.

12. Michalewska B., Żupańska B., Pelc-Kłopotowska M. i wsp.: Alloimmunizacja u chorych na niedokrwistość auto-immunohemolityczną oraz genotypowanie krwinek czerwonych w celu udoskonalenia doboru krwi do przetoczeń. „J Transfus Med.”, 2009, 2, 14-19.

13. Guz K., Orzińska A., Michalewska B. i wsp.: Molecular biolo­gy methods for blood cell antigens genotyping in reference laboratories. „J Transf Med.”, 2019, 12 (4), 199-205.

14. Guz K., Orzińska A., Brojer E.: Rozwój technologii opartych na metodach biologii molekularnej do oznaczania grup krwi. „Journal of Transfusion Medicine”, 2019, 12, 56-64.

15. Orzińska A., Guz K., Brojer E. i wsp.: Badanie genu RHD płodu w osoczu zimmunizowanej matki Rh ujemnej pozwoliło na uniknięcie metod inwazyjnych i urodzenie zdrowego dziecka. „Gin Pol.”, 2004, 75, 12, 963-965.

16. Guz K., Brojer E., Żupańska B. i wsp.: Nieinwazyjna diagnostyka RHD płodu u RhD ujemnych kobiet ciężarnych – wyniki wstępne. „Gin Pol.”, 2004, 75, 21-25.

17. Orzińska A., Guz K., Brojer E. i wsp.: Preliminary results of fetal Rhc examination in plasma of pregnant women with anti-c. „Prenat Diagn.”, 2008, 28, 335-337.

18. Orzińska A., Guz K., Dębska M. i wsp.: 14 Years of Polish Experience in Non-Invasive Prenatal Blood Group Diagnosis. „Transfus Med Hemother.”, 2015, 42, 361-364.

19. Pogłód R., Rosiek A., Michalewska B. i wsp.: Analiza poważnych niepożądanych zdarzeń i poważnych niepożądanych reakcji poprzetoczeniowych w Polsce w latach 2011-2014. „Journal of Transfusion Medicine”, 2018, 11, 8-28.

fot. Istock

Ryc. 1. Struktura organizacyjna i system nadzoru nad krwiodawstwem i krwiolecznictwem oraz nad badaniami z zakresu immunologii transfuzjologicznej w Polsce

Ryc. 2. Liczba pracowni immunologii transfuzjologicznej w podmiotach leczniczych podległych nadzorowi merytorycznemu poszczególnych Centów Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa

Tab. 1. Badania z dziedziny immunohematologii krwinki czerwonej wykonywane w laboratoriach referencyjnych IHiT